華南農業大學動物科學學院，國家生豬種業工程技術研究中心克隆技術是指通過無性繁殖獲得基因型相同個體的技術。在哺乳動物中，體細胞核移植技術是應用最廣泛、最有效的克隆技術之一。通過先進的顯微操作技術將體細胞的細胞核移入去核的卵母細胞中，並激活重構的卵母細胞使之發育成為一個新的動物個體，稱為體細胞核移植技術（Somatic Cell Nuclear Transfer, SCNT）。SCNT的主要程序包括核供體體細胞選擇與處理、受體卵母細胞準備、重構胚胎構建（去核卵母細胞與供體核融合）、重構胚胎激活、重構胚胎體外培養、胚胎移植至同期發情處理的代孕母豬、飼養管理代孕母豬至克隆小豬出生（圖1）。
圖1 體細胞核移植技術路線圖
自從首次成功克隆出哺乳動物綿羊「多莉（Dolly）」以來，已經陸續成功克隆了20多種哺乳動物，包括牛、小鼠、山羊、豬、兔、貓、馬、大鼠、狗、食蟹猴等。而SCNT也已經在醫藥生產、物種保存、家畜繁殖和幹細胞治療等方面得到廣泛應用。目前，世界上已有幾個生物技術公司可提供商業化的動物克隆服務，例如美國的Trans Ova Genetics公司可提供豬、牛、山羊和綿羊的商業化克隆服務；美國的ViaGen Pets公司可提供寵物狗、貓和馬的商業化克隆服務；還有近年在中國成立的北京希諾谷生物科技有限公司和博雅秀巖生物技術有限公司可提供寵物狗和貓的商業化克隆服務，以及河南創源生物技術有限公司可提供豬的商業化克隆服務。儘管已經成功克隆出了多種動物，但克隆胚胎的發育出生效率很低，且出生的克隆動物常存在生理缺陷、早衰等問題，所以克隆效率低是限制SCNT應用的關鍵問題之一。本文通過簡要介紹豬克隆技術在養豬業和生物醫藥領域的應用，並討論了克隆技術應用存在的問題和提高克隆效率的方法，以期為豬克隆技術的發展與應用提供參考。
優秀種豬具有良好的生產性能，因此，優秀種豬的擴繁可提高豬場的經濟效益。若採用傳統的有性繁殖技術（自然交配和人工授精）對優秀種豬進行擴繁，由於基因在生殖傳遞過程中存在分離和自由組合的遺傳規律，使得優秀種豬通過有性繁殖產生的後代的基因型與親代不同，所以不一定性能優秀。而利用克隆技術對優秀種豬進行無性複製擴繁，可產生大批量的基因型一致的優秀克隆個體，從而可延伸優秀種豬的利用時間和空間，縮短育種年限，加快遺傳進展和提高養殖效益。薛振華等人通過選取優秀種公豬的耳組織成纖維細胞作為核供體與體外培養成熟的豬卵母細胞進行核移植製備克隆胚胎，後續進行胚胎移植，並比較了克隆豬與普通公豬體質量和體尺的差異，結果顯示差異並不顯著，證實了SCNT用於複製優秀種豬的可行性。我國是一個豬種資源非常豐富的國家，在1984年已列入《中國豬品種志》的豬種就有66個品種。在豬種資源中，許多地方豬種都有其自身的優勢，例如太湖流域的太湖豬有高繁殖力，東北地區的民豬具有強適應性，我國特有的香豬肉質好等。然而隨著各地保種工作不當又盲目引進外來品種進行雜交，使原有品種數量減少、品質下降，甚至有的豬種瀕臨絕種。因此，地方豬種資源的保種工作至關重要，對我國豬種資源可持續性利用具有重大意義。活體保存是應用最普遍的方法，但它存在許多弊端，例如所需成本高、實際操作困難、易受環境影響等。隨著克隆技術的發展，若將SCNT應用到保種工作中，可簡化豬種資源的保種程序，減少人力物力資源投入。廣東溫氏食品集團股份有限公司在2013年運用手工克隆技術成功培育出25頭克隆萊蕪豬，證實了克隆技術在中國地方豬種保種工作中的可行性。受精卵原核注射技術一直以來是獲得轉基因動物最有效的方法，但因其基因的整合時間和位置是隨機的，從而導致生產轉基因動物效率低、成本高等。隨著克隆技術的發展，SCNT與基因修飾技術相結合可以共同用於生產轉基因豬。不僅可以提高轉基因豬的生產效率，還可以對內源基因進行修飾獲得一系列具有優良經濟性狀的基因修飾豬。例如豬CD163蛋白是藍耳病病毒感染豬肺泡巨噬細胞的主要受體，王少華等人通過對CD163基因進行敲除，同時結合SCNT技術獲得2頭抗藍耳病的克隆豬。而豬肌肉生長抑制素基因（MSTN）是肌肉生長的負調節因子，Wang等人利用CRISPR/Cas9系統將MSTN基因敲除，再經SCNT獲得表現雙肌的克隆豬。因此，通過利用SCNT和基因編輯技術可培育出具有優良經濟性狀的新品種豬。
2.1 人類異種器官移植供體豬製備
隨著終末期器官衰竭等疾病日益增多，器官移植就成了治療人類器質性疾病最理想的治療方法。由於人源器官資源有限，異種器官移植就成了緩解供體短缺問題最有效的方法。因豬具有與人類相似的器官大小、功能以及解剖學特徵等，又不存在靈長類動物方面的倫理問題，因此在人類異種器官移植方面具有巨大的應用前景。但作為異種移植供體仍面臨著兩大難題：免疫分子不相容性障礙和豬內源性逆轉錄病毒（Porcine Endogenous Retrovirus, PERVs）的傳播風險。α-1,3-半乳糖基轉移酶（α-1,3-galactosyltransferase, GGTA1）催化合成的α-1,3-半乳糖（Galactose-α-1,3-galactose, Gal）在異種器官移植中會引起超急性排斥反應，豬體內的補體系統激活也會引起排斥反應。而通過GGTA1基因敲除，並轉入補體調節因子可以使異種移植的器官存活時間更長和功能效應得到顯著提高，例如在2016年，Mohiuddin等人將GTKO/hCD46/hTBM基因編輯豬的心臟異種移植到狒狒體內，並結合免疫抑制劑維持治療，使其存活時間最長達到945天。而PERVs作為整合到豬基因組中的病毒，可感染多種人源細胞。在2017年，Niu等人[21]通過利用CRISPR/Cas9滅活豬的原代細胞系中所有的PERVs，並通過SCNT產生PERVs滅活豬，而且在後期的生長發育過程中沒有發現PERVs感染，因此可為異種器官移植提供安全有效的資源。與其他動物相比，由於豬具有與人類相似的解剖結構、生理特性以及疾病發生機理等，因此，豬被認為是目前作為研究人類疾病最佳的動物模型。人類疾病模型可以通過基因修飾技術與克隆技術相結合來製備，例如Zhou等人利用CRISPR/Cas9分別對豬胎兒成纖維細胞的TYR基因以及PARK2和PINK1雙基因進行敲除，再通過SCNT成功構建人類白化病和帕金森病模型豬，證實了豬克隆技術在人類疾病模型製備中的應用，可為醫藥臨床應用前試驗提供動物模型。隨著基因編輯技術與SCNT的發展，對豬的功能蛋白進行人源化修飾可用於生產藥用蛋白。Yang等人利用CRISPR/Cas9系統對豬成纖維細胞中的INS基因進行編輯，結合SCNT技術成功獲得了能在豬胰腺中表達人胰島素的轉基因豬，可用於治療糖尿病患者，也為胰島異種移植提供更加理想的供體。Peng等人運用CRISPR/Cas9將人白蛋白cDNA敲入豬Alb基因位點的起始密碼子下遊，首次獲得製備人重組血清白蛋白的豬生物反應器。隨著醫療技術的進步，人們對重組蛋白藥物的需求逐漸增加。而豬具有資源豐富、生產力高、成本低等優勢，因此，可作為生產重組蛋白藥物的主要生物反應器。
3.1 豬克隆技術應用存在的問題
自從2000年第一頭克隆豬誕生以來，有關克隆豬的研究就迅速發展起來。然而，由於豬的克隆效率仍低，克隆胚胎在發育過程中也常常表現出流產、死亡等異常現象，這在很大程度上限制了克隆技術在豬中的發展和應用。而引起克隆胚胎異常發育的因素有很多，例如技術操作不當、培養環境不適等。經大量研究發現，表觀遺傳學重編程異常是導致克隆胚胎發育缺陷的主要原因。表觀遺傳修飾是促進基因正確表達的主要因素，而在克隆胚胎中常見異常的表觀遺傳修飾模式，從而導致與發育相關的重要基因不能正確表達，使克隆胚胎發育異常。表觀遺傳學重編程異常主要包括DNA甲基化異常、組蛋白修飾異常、Xist基因異常激活等。
3.2 提高克隆效率的方法
小鼠作為哺乳動物研究的模式生物，在研究表觀遺傳學重編程及改進克隆技術等方面具有顯著的優勢。目前，對克隆小鼠中的表觀遺傳學重編程已有了一定的研究進展，例如Rybouchkin等人運用組蛋白脫乙醯酶抑制劑（Histone deacetylase inhibitor, HDACi）曲古他汀A（TSA）維持組蛋白的高乙醯化，形成開放的染色質結構，確保供體基因組可與重塑因子結合進行重編程。隨後Matoba等人通過基因敲除或RNA幹擾介導的基因敲除使位於X染色體上的非編碼基因Xist正常表達，從而使小鼠克隆胚胎的存活率提高了10倍。隨著對克隆小鼠表觀遺傳學重編程的研究逐漸成熟，研究者們開始探討是否可以採用類似的方法來提高豬的克隆效率。在2010年，Zhao等人研究發現了一種新型的HDACi「Scriptaid」可使豬克隆胚胎的囊胚率提高2倍多，克隆效率提高4倍。2016年，Zeng等人借鑑在克隆小鼠中的研究，採用相同的方式抑制Xist基因表達，結果顯示克隆胚胎發育成足月仔豬、活仔豬和健康仔豬的比率（0.53%、0.43%、0.17%）均高於未經處理的對照組（0.48%、0.32%、0.08%），證實了抑制Xist基因的表達可提高克隆豬的發育能力。因此，借鑑提高克隆小鼠發育能力的方法來提高豬克隆胚胎發育效率是一個行之有效的策略。隨著克隆技術在養豬業中的發展，使得優秀種豬的擴繁和地方種豬的保種工作更加經濟、便捷。而且克隆技術與基因編輯技術的結合，可擴大基因編輯克隆豬的應用範圍。不僅為養豬業培育出新的優良品種，還可運用於生物醫藥領域構建人類疾病模型、生產醫療藥物等。雖然對豬克隆技術的研究已取得了明顯的進展，但仍存在克隆效率低等問題，因此，對技術的完善與改進至關重要。異常的表觀遺傳修飾是導致克隆效率低的主要原因，隨著測序技術的發展，使得對異常的表觀遺傳學重編程機制的研究更加快速準確。通過對異常的表觀遺傳修飾進行修改，可提高克隆效率，從而極大的促進和推動克隆豬在養豬業和生物醫藥領域的應用。
作者：王雯競
華南農業大學動物科學學院碩士研究生，專業方向為動物遺傳育種與繁殖。