作者：倪偉波 唐琳
超分辨成像技術是21世紀發展最為迅速的研究領域之一。在超分辨成像技術的推動下，人類有了探索微觀領域的有效途徑和方法，生物學特別是細胞生物學由此進入一個全新時代。
工欲善其事，必先利其器。成像技術是極為交叉的尖端技術，需要新算法、新儀器、新探針融合創新，從而為生命科學和醫學研究提供新工具。然而，就目前而言，高端成像儀器/探針等高精尖設備、關鍵技術都被國外進口產品所壟斷，卡住了我國提高生命科學研究技術水平的「脖子」。
近日，英國皇家化學會旗艦期刊Chemical Science以在線形式發表的一項最新研究成果顯示，來自北京大學和西湖大學的研究人員合作研發出兩款新型探針——PK Mito Red（PKMR）和 PK Mito Deep Red（PKMDR），首次在活細胞水平上實現了光毒性的明顯降低。
突破超分辨成像「卡脖子」問題
為了能進一步揭開細胞生物學過程的神秘面紗，研究人員發展了各種各樣的生物成像技術。其中，螢光超解析度成像因簡單的成像條件及對生物樣品的相容性脫穎而出。
為了揭示更精細的結構，螢光超解析度成像往往需要更多的光子，因此業內一直將目光聚焦在如何改善螢光探針光穩定性的問題上。但其實活細胞超解析度成像中除了需要螢光探針在漂白之前發出更多的光子外，漂白過程中產生的光毒性往往也不可忽視。
2018年，北京大學分子醫學研究所陳良怡團隊研發的海森結構光顯微鏡（Hessian SIM），首次揭示了活細胞中線粒體的精細內嵴結構及其動態變化。為了滿足新型光學顯微鏡的需求，國內外諸多科研團隊發展了多種光穩定性的新型線粒體探針，用於觀察線粒體內嵴結構。
然而，超解析度成像需要的高激發光強往往使線粒體螢光探針更易產生活性氧物種（ROS），而且其不隨採樣時間的間隔增加而消失。這樣的超解析度成像，即便螢光探針本身並未被完全漂白，也將迅速破壞線粒體內嵴，使線粒體發生腫脹、變圓。
「光毒性雖然對光學解析度沒有影響，但是會對細胞結構產生極大影響，細胞會受傷害甚至死亡，這種情況下看到的東西與生理反應完全不同。」此項工作的通訊作者之一、北京大學分子醫學研究所研究員陳知行告訴《中國科學報》。
換句話說，活細胞超解析度成像需要解決的主要問題實際上是改善光毒性，而不僅僅是光漂白。
針對這一領域的新痛點，陳知行團隊利用分子內綴合環辛四烯的策略，成功合成了兩種新型低光毒性線粒體螢光探針——PKMR和PKMDR，首次在活細胞水平上實現了光毒性的明顯降低。
不僅如此，陳知行團隊通過與陳良怡團隊、西湖大學雷凱團隊合作，通過更進一步的實驗，證明新染料對細胞的光毒性顯著低於MitoTracker系列商業染料，可實現1000幀以上、線粒體內嵴形狀基本不變的超分辨成像；首次證明該探針可以用於渦蟲的幹細胞流式分選，且不影響幹細胞的多能性，可以真正用於研究如幹細胞重編程等生理過程中的線粒體功能。
低光毒 更溫柔
科學研究不僅要「知其然」，更要「知其所以然」。在這項研究中，三支團隊不僅讓人們重新認識到光毒性對細胞結構的影響，還使用不同的實驗手段和方式驗證了光毒性是成像試驗中更重要的制約因素，為透徹揭示兩種新型低光毒線粒體螢光探針提供了科學的解釋。
陳知行介紹，螢光探針的光毒性一般來自於激發過程中由第一激發單重態（S1）經過系間竄躍產生的第一激發三重態（T-1），T1態與氧氣作用可產生單線態氧等活性氧物種，進而破壞生物分子。
為了最大程度抑制這一過程從而減少光毒性，團隊採用了之前應用於染料雷射、單分子成像等領域減少光漂白的分子內綴合三線態淬滅劑（自修復染料 Self-Healing Dye）的策略。HeLa細胞的光照存活實驗發現，常見三線態淬滅基團中只有環辛四烯（COT）能有效降低螢光成像中的光毒性。更為重要的是，團隊還觀察到，能夠降低光漂白的基團（硝基苯）並不一定能減少光毒性。
正因為如此，「螢光探針的光毒性和光漂白性質應該被分別測試，但以往的螢光探針設計中往往忽視了對探針光毒性等性質的詳細表徵。」陳知行解釋道。
在此基礎上，團隊以COT作為三線態淬滅基團，合成了兩種以Cyanine為母核的螢光探針PKMR和PKMDR。HeLa細胞的光照存活實驗表明，新探針的光毒性較對應光譜的商業探針（MitoTrackers）低5倍以上，並能在相同條件下提供相同甚至更高的亮度。
「可以說，此項工作為領域找到了新方向，未來希望能將探針的光毒性降到更低，甚至徹底消除。」陳知行充滿信心地表示。
協同創新 邁向極致
陳知行、陳良怡及其團隊背靠的北京大學分子醫學研究所成立於2005年，圍繞生物成像這個新興的交叉領域，分子醫學所運籌帷幄，前瞻性布局，創立了分子探針技術研究室，使得探針技術、顯微鏡技術以及科學問題能夠相互啟發，緊密合作。
多年來，研究室始終踐行分子醫學所「集成創新」的理念和「從分子到人」的戰略，通過開發多樣、精準且精美的分子工具，推動生命科學基礎研究各個層面的廣泛發展。
2018年6月，回國後的陳知行加入到分子醫學所。彼時，陳良怡團隊研發的Hessian SIM不僅將光學顯微鏡的性能提升到一個全新的高度，還從數學和物理兩方面大大改善了超分辨成像技術的光毒性。
為了將超分辨成像技術做到極致，必須要從化學探針方向進行協同創新。而化學研究出身的陳知行的加入，無疑為團隊注入了一股強勁的動力。
從2018年6月開始進行探針研究，到如今取得重要突破，團隊只用了一年多的時間，卻迭代了三代設計，最終找到了有效的方案。
長期從事渦蟲幹細胞再生研究的雷凱團隊在測試了新探針在渦蟲幹細胞分選領域的應用後，發現新探針標記線粒體可以幫助分選出幹細胞群，而且新探針標記的幹細胞在體外仍能維持較好的活性和乾性，充分展示了其在流式螢光分析分選中優秀的生物相容性。
更難能可貴的是，新探針在長時程超分辨成像方面也顯示出卓越的優勢。Hessian SIM成像結果顯示，新探針在提供了接近2D Hessian-SIM理論解析度，展示了清晰的線粒體嵴結構圖像的同時，最大程度地保留了線粒體健康的原始形態。而使用商業染料MitoTracker Red CMXRos （MTR）標記的線粒體在140幀左右就發生了腫脹和明顯形變，200幀以上已不可見嵴等正常生理結構，而PKMR標記的線粒體可以提供1000幀以上的健康線粒體圖像，2000幀左右線粒體的形變程度仍小於商業探針的200幀。
在科研探索的道路上，創新永無止境。「下一步，我們將繼續在數學、物理、化學三方面協同推進，把技術推到極致。同時，爭取將來發力轉化，打破外國公司在高端成像儀器/探針方向的壟斷，真正實現為生物醫學研究者提供超越國外產品的國產高端成像工具。」陳知行表示。