細胞器是細胞中具有特定結構和功能的亞結構單元，與癌症等疾病密切相關。相對於組織和細胞層次的治療，細胞器靶向的治療可以進一步提高癌細胞的精準殺滅效率並降低副作用。華南理工大學唐本忠院士、高蒙副研究員和任力教授開發了一種診療一體化納米探針，可實現線粒體和溶酶體靶向的化療與光動力協同治療，而且可通過雙通道螢光點亮成像實時監測細胞內藥物釋放過程。
作者以線粒體靶向的AIE-Mito-TPP分子和光敏劑AlPcSNa4為底物，通過靜電、疏水和π-π相互作用，自組裝形成診療一體化納米探針AIE-Mito-TPP/ AlPcSNa4 NPs（圖1）。由於AIE-Mito-TPP和AlPcSNa4之間存在螢光共振能量轉移（FRET）過程，且光敏劑AlPcSNa4在聚集態時存在螢光自我猝滅效應，AIE-Mito-TPP/AlPcSNa4 納米探針自身幾乎不發螢光。當該納米探針通過內吞作用進入細胞的溶酶體後，在溶酶體的弱酸性環境下逐漸解離，釋放AIE-Mito-TPP和AlPcSNa4，並分別靶向線粒體和溶酶體；同時在細胞內的釋放過程可通過同時恢復AIE-Mito-TPP的綠色螢光和光敏劑AlPcSNa4的紅色螢光實時監測。聚集於線粒體的AIE-Mito-TPP分子，能夠有效降低線粒體膜電勢並抑制ATP的合成，從而破壞線粒體的功能；同時溶酶體中的AlPcSNa4在近紅外光照下產生的活性氧（ROS），能夠有效破壞溶酶體的結構和功能。因此該AIE-Mito-TPP/AlPcSNa4納米探針能夠實現線粒體和溶酶體雙細胞器靶向的化療與光動力協同治療，並通過雙通道螢光點亮成像實時監測細胞內藥物釋放過程。
圖1（A）AIE-Mito-TPP和AlPcSNa4自組裝製備AIE-Mito-TPP/AlPcSNa4納米探針的示意圖；（B）線粒體和溶酶體靶向的化療與光動力協同治療以及雙通道螢光自我點亮監測示意圖。
作者通過透射電子顯微鏡（TEM）和動態光散射（DLS）表徵了AIE-Mito-TPP/AlPcSNa4 NPs和AIE-Mito-TPP的粒徑和表面電勢。相對於AIE-Mito-TPP分子形成的無序聚集體，AIE-Mito-TPP/AlPcSNa4 可自組裝為球狀納米粒子，其平均水合粒徑約為77 nm，分散係數為0.161，表面電勢為1.04 mV（圖2）。
圖2 AIE-Mito-TPP/AlPcSNa4 NPs和AIE-Mito-TPP的粒徑和表面電勢表徵：（A）透射電鏡圖；（B）水合粒徑分布圖；（C）表面電勢圖。
作者進一步考察了鹽度、pH和表面活性劑（SDS）對AIE-Mito-TPP/AlPcSNa4 NPs的紫外-可見吸收和螢光光譜的影響，證實AIE-Mito-TPP/AlPcSNa4 NPs是通過靜電、π–π和疏水作用自組裝而成。由於AIE-Mito-TPP的發射光譜和和AlPcSNa4的激發光譜有部分重疊，所以二者自組裝形成的AIE-Mito-TPP/AlPcSNa4 NPs，可有效發生螢光共振能量轉移（FRET）過程，同時由於AlPcSNa4在聚集態的螢光自我猝滅效應，AIE-Mito-TPP/ AlPcSNa4 NPs自身幾乎不發螢光（圖3）。
圖3（A）AIE-Mito-TPP (2.50 × 106 M)，AlPcSNa4 (1.25 × 106 M)和AIE-Mito-TPP/AlPcSNa4 NPs (2.5 × 106 M的AIE-Mito-TPP和1.25 × 106 M的AlPcSNa4)的紫外-可見吸收光譜圖；（B）AIE-Mito-TPP (2.50 × 106 M)的螢光發射光譜和AlPcSNa4(1.25 × 106 M)的激發光譜圖；（C）AIE-Mito-TPP (2.50 × 106 M)，AlPcSNa4 (1.25 × 106 M)和AIE-Mito-TPP/AlPcSNa4 NPs (2.50 × 106 M的AIE-Mito-TPP和1.25 × 106 M的AlPcSNa4)在水溶液中的螢光光譜圖；（D）AIE-Mito-TPP，AlPcSNa4和AIE-Mito-TPP/AlPcSNa4 NPs在紫外光照（365 nm）下的螢光照片。
作者進一步通過雷射共聚焦螢光成像和流式細胞術監測了AIE-Mito-TPP，AlPcSNa4和AIE-Mito-TPP/AlPcSNa4 NPs進入黑色素瘤A375細胞的過程。發現AIE-Mito-TPP自身可快速進入細胞內線粒體，而AlPcSNa4自身由於帶有負電荷，幾乎不能進入細胞。AIE-Mito-TPP/AlPcSNa4 NPs可通過內吞作用快速進入細胞內溶酶體，在溶酶體的弱酸性環境下逐步解離，並逐漸恢復AIE-Mito-TPP和AlPcSNa4的綠色和紅色螢光。因此，該納米探針在細胞內的釋放過程可通過雙螢光通道實時監測（圖4）。
圖4 （A）AIE-Mito-TPP (2.50 × 106 M)，（B）AlPcSNa4 (1.25 × 106 M)和（C）AIE-Mito-TPP/AlPcSNa4 NPs (2.5 × 106 M的AIE-Mito-TPP和1.25 × 106 M的AlPcSNa4)在細胞內隨時間變化的螢光成像圖，（D）流式細胞分析結果。
作者通過與商品化的線粒體染料MitoTracker Red和溶酶體染料LysoTracker Red進行共染，證實了AIE-Mito-TPP選擇性聚集於線粒體中（共定位係數為0.87），而AlPcSNa4主要分布於溶酶體中（共定位係數為0.79）。在660 nm近紅外光照4 min後，AlPcSNa4的紅色螢光分布於整個細胞中，表明AlPcSNa4作為光敏劑，可通過生成活性氧（ROS），有效破壞溶酶體的結構（圖5A-B）。作者進一步考察了AIE-Mito-TPP，AlPcSNa4和AIE-Mito-TPP/AlPcSNa4 NPs的體外細胞毒性，發現在近紅外光照下（660 nm，0.1 W cm2，30 min )，AIE-Mito-TPP/AlPcSNa4 NPs組對應的細胞存活率降低至17.7%，而AIE-Mito-TPP和AlPcSNa4 組對應的細胞存活率分別為60.2%和85.6%。作者進一步利用Annexin V-FITC/PI 試劑盒，測定了在近紅外光照下，AIE-Mito-TPP，AlPcSNa4和AIE-Mito-TPP/AlPcSNa4 NPs對應的細胞凋亡率（圖5C）。發現AIE-Mito-TPP/AlPcSNa4 NPs組對應的細胞凋亡率為77.2%，而單獨AIE-Mito-TPP和AlPcSNa4對應的細胞凋亡率分別為27.9%和4.1%。這些結果表明AIE-Mito-TPP/AlPcSNa4 NPs在近紅外光照下，通過線粒體靶向的化療和溶酶體靶向的光動力治療的協同作用，能夠有效殺滅癌細胞（圖5D）。
圖5 （A）隨孵育時間增加，AIE-Mito-TPP/AlPcSNa4納米探針(2.5 × 106 M的AIE-Mito-TPP和1.25 × 106 M的AlPcSNa4)與LysoTracker Red共染的螢光成像變化圖；（B）在近紅外光照下（660 nm，0.1 W cm2，0–4 min），AIE-Mito-TPP/AlPcSNa4 (2.5 × 106 M的AIE-Mito-TPP和1.25 × 106 M的AlPcSNa4)納米探針與LysoTracker Red共染的螢光成像變化圖；（C）AIE-Mito-TPP，AlPcSNa4和AIE-Mito-TPP/AlPcSNa4 NPs在暗中和光照條件下的體外細胞毒性結果；（D）AIE-Mito-TPP (1.0 × 106 M)，AlPcSNa4 (0.5 × 106 M)和AIE-Mito-TPP/AlPcSNa4 NPs (1.0 × 106 M的AIE-Mito-TPP和0.5 × 106 M的AlPcSNa4)在光照下的細胞凋亡檢測結果。
作者進一步通過體內腫瘤治療實驗證實，AIE-Mito-TPP/AlPcSNa4 NPs在近紅外光照下（660 nm，0.1 W cm2），能夠顯著抑制腫瘤的生長（圖6A）。將腫瘤從裸鼠體內剝離，檢測腫瘤的大小、重量並切片進行HE染色（圖6B，C，E），進一步證實了AIE-Mito-TPP/AlPcSNa4 NPs在光照下能夠有效抑制腫瘤的生長。同時，在治療期間小鼠的體重未發生明顯變化（圖6D），表明該納米探針具有很好的生物相容性。
圖6 （A）裸鼠體內腫瘤體積指數隨時間變化圖；（B）不同條件下（AIE-Mito-TPP, AIE-Mito-TPP (+ L)，AlPcSNa4, AlPcSNa4 (+ L)，AIE-Mito-TPP/AlPcSNa4 NPs和 AIE-Mito-TPP/AlPcSNa4 NPs (+ L)），治療21天後的平均瘤重；（C）治療21天後，從小鼠中剝離的腫瘤照片（n = 5）；（D）裸鼠體重隨時間的變化圖；（E）腫瘤切片的HE染色圖。
為了進一步評估AIE-Mito-TPP/AlPcSNa4 NPs的生物安全性，在治療21天後，通過HE染色心、肝、脾、肺、腎器官，未發現明顯的炎症和損傷。同時，通過分析尿素氮、谷丙轉氨酶、穀草轉氨酶和血清總蛋白的表達水平，發現治療組的數值與對照組的數值相近，表明該納米探針具有很好的生物安全性（圖7）。
圖7 （A）心肝脾肺腎的HE染色圖；（B-E）血清中的尿素氮（BUN）、谷丙轉氨酶（ALT）、穀草轉氨酶（AST）和總蛋白（TP）的指標圖。
該工作製備了診療一體的AIE-Mito-TPP/AlPcSNa4納米探針，通過內吞作用快速進入癌細胞，在細胞內的釋放過程可通過雙螢光通道實時點亮監測，同時線粒體靶向的AIE-Mito-TPP可有效破壞線粒體的功能，AlPcSNa4可通過光照生成的活性氧有效破壞溶酶體的結構和功能。該線粒體和溶酶體雙細胞器靶向的化療與光動力協同治療的策略以及螢光自我點亮監測功能，有望在成像指導下的癌症精準治療領域有廣闊的應用前景。
這一成果近期發表在Advanced Functional Materials上，文章的第一作者為華南理工大學博士研究生陳曉輝，文章的通訊作者為高蒙副研究員，任力教授和唐本忠院士。
全文連結：
https://doi.org/10.1002/adfm.201804362
來源：高分子科學前沿
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