霍亂弧菌是流行性腹瀉病、霍亂的病原體。雖然霍亂毒素（CT）和毒素調節菌毛（TCP）是已知的主要毒力決定因素，其致病機制是與本地微生物（統稱為腸道微生物）相互作用的結果。腸道微生物的一個關鍵特徵是其對腸道致病性感染的保護能力，稱為「定植抗性」。最近的研究表明，共生微生物是抵禦入侵病原體的屏障，腸道感染是共生菌、病原體和宿主腸道組織之間多層次相互作用的結果。然而，目前尚不清楚腸道微生物群的幹擾（特別是通過物種和代謝物水平的變化）是如何影響宿主的感染抵抗力。
韓國延世大學醫學院研究團隊於2019年在《Microbiome》上發表了論文「Commensal-derived metabolites govern Vibrio cholerae pathogenesis in host intestine」。通過解析CL引起的微生物菌群組成變化及其對宿主霍亂弧菌易感性的影響，揭示了共生代謝產物是宿主抵抗霍亂弧菌感染的關鍵決定因素。
16s rRNA：鏈黴素（SM）、萬古黴素（VAN）和克林黴素（CL）三種不同抗生素分別治療8周齡的成年C57BL/6特異性無病原體（SPF）小鼠。治療5天後，收集小鼠糞便。
代謝組：SPF，SPF+Vc感染、SPF+CL處理，SPF+CL處理+Vc感染的小鼠盲腸內容物。
1. 克林黴素處理的成年小鼠腸道菌群組成發生顯著變化，對霍亂弧菌感染敏感
腸道病原體的定植取決於宿主腸道內固有微生物的組成。為了觀察不同實驗條件下腸道菌群組成變化對宿主感染抵抗力的影響，作者用鏈黴素（SM）、萬古黴素（VAN）和克林黴素（CL）三種不同抗生素分別治療成年C57BL/6特異性無病原體（SPF）小鼠（8周齡）。治療5天後，收集小鼠糞便，通過16s rRNA基因測序分析微生物群組成，結果發現五個細菌門在各組之間具有特徵性分布。
在未經治療的對照組中，擬桿菌是最豐富的一個門，約佔整個微生物種群的80%；VAN處理導致疣狀結腸菌和蛋白細菌門的細菌細胞增殖；CL處理的結果，類桿菌門消滅，而硬壁菌門在數量上基本保持不變，而蛋白質細菌門豐度增加，進一步證明CL對抑制兼性厭氧菌的生長無效。
霍亂7號流行株N16961感染各抗生素組小鼠後，作者檢測感染後小鼠腸道微生物群組成變化。在對照組和SM治療組中，霍亂弧菌感染後，微生物群組成變化不大。在對N16961感染的反應中，VAN預處理後擬桿菌門的相對豐度增加。在CL處理的小鼠中，由於霍亂弧菌感染，厚壁菌門的相對豐度增加，而蛋白細菌門的相對豐度減少（圖1h）。重要的是，在圖1h中檢測到的蛋白細菌門中，約8.81%來自霍亂弧菌特異的16s rRNA基因序列。這一結果值得特別注意，因為霍亂弧菌特異性序列在其他組的蛋白菌群中沒有檢測到（圖1f，g）。
以上結果表明，霍亂弧菌可以在CL處理的條件下主動定植於成年小鼠的腸道。當霍亂弧菌感染成年小鼠的腸道菌群組成被CL處理改變時，它們會誘發類似霍亂的症狀。
圖1抗生素治療後宿主對霍亂弧菌感染反應的微生物種群變化
2. 用CL處理小鼠的糞便移植無菌小鼠後，無菌小鼠易感染霍亂弧菌
CL誘導的腸道菌群組成變化與霍亂弧菌感染易感性升高有關，但之前的研究也表明，成年小鼠霍亂弧菌感染性增強可能歸因於CL誘導的宿主免疫反應調節。為了解決這一問題，作者對無菌小鼠進行糞便移植（FMT），並檢測糞便移植後無菌小鼠是否對霍亂弧菌感染產生不同的抵抗力。
經過3天的移植穩定期，霍亂弧菌感染無菌小鼠。結果用PBS處理的對照糞便移植無菌小鼠對感染產生了較強的抵抗力，而且沒有從移植小鼠的小腸和盲腸中找到活的霍亂弧菌。而CL處理的糞便移植無菌小鼠中，盲腸和糞便中的霍亂弧菌定植率分別比對照組高出104倍和103.4倍（圖2b）。霍亂弧菌定植期間，在CL處理的糞便移植無菌小鼠中，一種關鍵的毒力決定因子CT產量增加。以上結果表明，CL處理引起的腸道菌群組成的改變直接導致小鼠宿主更易感染霍亂弧菌。
圖2 用CL處理過的小鼠糞便移植的無菌小鼠易感染霍亂弧菌
3.Bacteroides vulgatus是擬桿菌門的優勢種
根圖1結果，CL預處理小鼠中霍亂弧菌感染的升高可歸因於擬桿菌的減少或蛋白質細菌門的增加。同時也注意到：蛋白質細菌群體同樣在VAN處理的小鼠中充分繁殖，這組小鼠沒有出現霍亂樣症狀（圖1c）。其次，感染前的擬桿菌門相對豐度從38%增加到感染後的61%（圖1c，g）。基於這些結果，作者推測擬桿菌門主要佔據成年小鼠腸道，在保護宿主免受霍亂弧菌感染方面起著關鍵作用。
為了深入了解擬桿菌門的菌種組成，作者使用16s rRNA測序進行了菌種分析。確定了三種不同的細菌屬於擬桿菌門：Bacteroides vulgatus、 Parabacteroides goldsteinii和Bacteroides caccae。在對照小鼠中，B. vulgatus數量最多，相對豐度大於整個種群的50%（圖3.1）。VAN處理後，P.goldsteinii繁殖，而B.vulgatus的種群數量減少。但在霍亂弧菌感染後，B.vulgatus的相對豐度恢復到原來的水平。在霍亂弧菌感染之前或之後，經CL處理的小鼠排出的糞便中均未檢測到與這三種細菌的16s rRNA基因序列。
圖3 抗生素治療和霍亂弧菌感染後微生物菌種的豐度變化
由於B. vulgatus是成年小鼠腸道中最主要的優勢種，接下來作者在更明確的條件下檢測B. vulgatus改變宿主對霍亂弧菌易感性的影響。在感染霍亂弧菌之前，用體外厭氧培養的B. vulgatus懸浮液處理無菌小鼠（live-Bv組），並用熱殺死的B.vulgatus作為額外的陰性對照（HK-Bv組）。感染後24小時後，與PBS和HK-Bv對照組相比，live-Bv組中小腸、結腸和糞便中的霍亂弧菌定植顯著減少。而HK-Bv組中的霍亂弧菌定植數目從未減少。這些結果表明，活躍的B. vulgatus存在於成年小鼠腸道中時，可以抑制霍亂弧菌的定植。
接下來，作者探討了B.vulgatus是否也有效地抑制了用於研究霍亂弧菌感染的幼鼠模型中的霍亂弧菌定植。實驗結果表明，B.vulgatus移植到幼年小鼠腸內時，也能有效抑制霍亂弧菌的定植，且B.vulgatus移植幼鼠感染引起的積液顯著減少。以上結果表明B. vulgatus抑制體內霍亂弧菌生長。
5. 代謝譜圖顯示直接調節腸道霍亂弧菌生長的特徵性代謝物
作者接下來進行了代謝組分析，以檢查代謝物分布是否因CL治療或霍亂弧菌感染而改變。結果一共鑑定到273種代謝物，對這些代謝物進行層次聚類分析，用熱圖顯示代謝物在四組樣本間的相對表達量。層次聚類結果表明CL處理比霍亂弧菌處理誘導更多的代謝物表達水平的變化；而CL誘導的代謝產物水平的變化可能創造了一個強烈促進霍亂弧菌生長和發病的環境。
表1列出了在對照SPF（化合物1~13）或CL處理（化合物14~27）小鼠中檢測到的最大數量的代謝物。在SPF小鼠盲腸中檢測到的13種分子中，除膽酸外，其餘均未在CL處理小鼠中檢測到，且短鏈脂肪酸（SCFA）是對照組中檢測最豐富的代謝物。14種化合物（14~27）被選為CL處理組的主要代謝物。在對照組中，這14個分子的相對數量要麼是不可檢測的（化合物14、21、23和27），要麼是相當小的。這些結果進一步證實了CL處理後小鼠腸道微生物的代謝譜發生了明顯的變化。
表1 SPF和CL處理小鼠腸道中佔優勢的代謝產物及其對霍亂弧菌生長的影響
作者接下來研究了這些主要化合物是如何控制霍亂弧菌生長的。在列出的27種化合物中，有效性篩選出來17種化學物進行功能驗證。作者監測了霍亂弧菌在M9培養基中的體外生長情況，生長曲線實驗揭示了能夠抑制和刺激霍亂弧菌生長的化合物。7種代謝產物（膽酸、丁酸、異丁酸、丙酸、戊酸、異戊酸和三甲胺）對霍亂弧菌生長有明顯抑制作用，且這些化合物在正常SPF小鼠腸道中的含量最大，但在CL處理的小鼠腸道中不存在或幾乎檢測不到。當培養基中含有NAG時，觀察到對霍亂弧菌的生長具有顯著促進作用，與NAG相比，葡萄糖酸和葡萄糖酸內酯對霍亂弧菌的生長也有促進作用。且與SPF對照組小鼠相比，CL處理小鼠體內檢測到的這些代謝物更為豐富。
總之，以上結果表明，CL誘導的宿主腸道變化明顯反映在代謝物水平的改變上，這種代謝譜的主要變化顯著影響霍亂弧菌的腸道生長。
6. CL處理成年小鼠可作為研究霍亂弧菌發病機制的模型
為了研究CL處理的小鼠是否可以作為描述霍亂弧菌感染的模型，作者用N16961及其ΔtcpA突變體（在腸道定植方面有缺陷的特徵性霍亂弧菌突變體）的1:1混合物感染了小鼠，通過競爭指數的計算比較了這兩個菌株的定殖能力。實驗結果表明CL處理的小鼠的體液積聚和細菌定植再次顯著增加，而PBS處理的對照組則沒有。CL處理小鼠小腸和盲腸的競爭指數（ΔtcpA/WT）的平均值分別為~0.29和~0.28，說明與WT N16961相比，ΔtcpA突變體表現出顯著降低的定殖能力。相比之下，當使用未經治療的成年小鼠時，兩種菌株之間的定殖能力沒有顯著差異。
以上結果表明，CL預處理不僅可以誘導細菌的活性定植，而且可以使我們更好地了解霍亂弧菌的發病機制。
圖6 霍亂弧菌ΔtcpA突變株在CL處理成年小鼠腸道定植中存在缺陷
7. CL引起的微生物群組成變化及其對宿主霍亂弧菌易感性的影響
基於以上結果，作者最後構建了CL引起的微生物群組成變化及其對宿主霍亂弧菌易感性影響的分子模型。
圖7 CL引起的微生物群組成變化及其對宿主霍亂弧菌易感性的影響
本文說明了小鼠腸道中擬桿菌門的優勢種Bacteroides vulgatus如何抑制霍亂弧菌（一種病原體）的感染。克林黴素（Clindamycin，CL）是一種選擇性地殺死厭氧菌的抗生素，因此擬桿菌可以從CL處理過的小鼠腸道中完全根除。擬桿菌缺失的成年小鼠感染霍亂弧菌後出現嚴重的霍亂症狀。無菌小鼠中定植Bacteroides vulgatus對霍亂弧菌感染具有抵抗力。經CL處理後，霍亂弧菌生長抑制代謝物（包括短鏈脂肪酸）的水平下降，而促進霍亂弧菌增殖的化合物水平升高。說明共生代謝產物是宿主抵抗霍亂弧菌感染的關鍵決定因素，而對成年小鼠進行CL預處理可產生一個簡單而有用的霍亂感染模型。
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