...顏寧團隊連續發表5篇Cell/Nature,提出了通用的解析膜蛋白的方法

2020-11-29 澎湃新聞

以下文章來源於iNature ，作者楓葉

iNature

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約30％的編碼基因編碼的膜蛋白（MPs）在眾多生理過程中起著至關重要的作用。膜蛋白是超過FDA批准藥物一半的靶標藥物。需要在近乎生理條件下對功能性膜蛋白進行高解析度的結構研究，以提供深入的機理理解並促進藥物發現。隨著單粒子冷凍顯微鏡（cryo-EM）的解析度革命，分離的膜蛋白的結構闡明已取得了快速進展。下一個挑戰是保留電化學梯度和膜曲率，以便對膜蛋白進行全面的結構闡明，而膜蛋白的生物學功能依賴於這些化學和物理特性。

2020年7月17日，顏寧團隊在PNAS 在線發表題為「Cryo-EM analysis of a membrane protein embedded in the liposome」的研究論文，該研究以特徵明確的AcrB為原型，提出了一種方便的工作流程，用於對嵌入脂質體中的膜蛋白進行冷凍-EM結構分析。結合優化的蛋白脂質體分離，冷凍樣品製備和有效的顆粒選擇策略，以3.9Å的解析度獲得了嵌入脂質體中的AcrB的三維（3D）重建。該研究方法可廣泛應用於具有獨特可溶域的膜蛋白的冷凍EM分析，為功能受跨膜電化學梯度或膜曲率影響的整體或外圍膜蛋白的冷凍EM分析奠定了基礎。

另外，2020年6月15日，顏寧及楊洪遠共同通訊在Cell 在線發表題為「Structural Basis of Low-pH-Dependent Lysosomal Cholesterol Egress by NPC1 and NPC2」的研究論文，該研究揭示了低pH依賴性膽固醇從NPC2傳遞到NPC1跨膜（TM）域的分子基礎。在pH 8.0時，在納米光碟和去汙劑中分別獲得3.6Å和3.0Å解析度的NPC1類似結構，揭示了連接N端結構域（NTD）和跨膜固醇傳感結構域（SSD）的隧道結構；在pH 5.5時，NTD表現出兩個構象，表明膽固醇向隧道輸送的運動。在通道的膜邊界發現了一個假定的膽固醇分子，TM2向SSD上的表面袋形成。最後，在pH 5.5時獲得了解析度為4.0Å的NPC1-NPC2複合物的結構，闡明了膽固醇從NPC2轉移到NPC1（NTD）的分子基礎。

2020年6月8日，顏寧團隊在PNAS 在線發表題為「Employing NaChBac for cryo-EM analysis of toxin action on voltage-gated Na+ channels in nanodisc」的研究論文，該研究介紹在洗滌劑膠束和納米圓盤中NaChBac的單粒子冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）分析。在兩種條件下，NaChBac的構象與潛在滅活的NavAb的構象幾乎相同。確定納米光碟中NaChBac的結構使研究人員能夠檢查脂質雙層中Nav通道的門控修飾劑毒素（GMT）。為了研究哺乳動物Nav通道中的GMT，該研究生成了一個嵌合體，其中Nav1.7的第二個電壓感測域中S3和S4區段的細胞外片段替換了NaChBac中的相應序列。此解決方案可實現毒素對接的可視化。因此，NaChBac可以用作膜環境中GMT與Nav通道之間相互作用的結構研究的便捷替代品。

2020年5月13日，顏寧等團隊在Nature 在線發表題為」Structural basis for catalysis and substrate specificity of human ACAT1「的研究論文，該研究介紹了人類ACAT1的冷凍電子顯微鏡結構。每個protomer都由九個跨膜段組成，這些段包圍了一個胞質通道和一個在預計的催化位點會聚的跨膜通道。結構指導的突變分析的證據表明，醯基輔酶A通過細胞質通道進入活性位點，而膽固醇可能從側面通過跨膜通道進入。這種結構和生化特徵有助於合理化ACAT1對不飽和醯基鏈的偏好，並提供對MBOAT家族中酶催化機制的見解（）。

2020年5月13日，顏寧等團隊在Nature 在線發表題為」Structure and mechanism of human diacylglycerol O-acyltransferase 1「的研究論文，該研究介紹了人類DGAT1的冷凍電子顯微鏡結構。每個DGAT1都有9個跨膜螺旋，其中8個形成保守的結構摺疊，將其命名為MBOAT摺疊。DGAT1中的MBOAT摺疊在膜中形成一個中空腔室，該腔室包圍著高度保守的催化殘留物。該腔室有兩個底物，脂肪醯基輔酶A和二醯基甘油的單獨入口。 DGAT1可以同型二聚體或同型四聚體形式存在，兩種形式具有相似的酶活性。DGAT1的N末端與鄰近的protomer相互作用，而這些相互作用是酶促活性所必需的（）。

生物膜包圍著拓撲隔離的隔室，包括細胞和細胞器，並為各種完整的和外圍的膜蛋白（MP）提供了棲息地。這些物理屏障使生命必需的電化學梯度得以生成和維持，這是由於離子和化學物質在整個不可滲透膜上的不對稱分布所致。各種生理過程都取決於這些梯度，例如由質子梯度（質子動力）驅動的三磷酸腺苷（ATP）合成和依賴跨膜電場存在的動作電位。因此，許多膜蛋白，例如電壓門控離子通道（VGIC）以及一級和二級活性轉運蛋白，都依賴於跨膜電化學梯度來執行其生物學功能。

除了駐留在膜的內部或表面之外，膜蛋白與膜之間的相互作用也對細胞壽命產生了深遠的影響。例如，許多外周膜蛋白定義了細胞器形成的膜輪廓。FoF1 ATP合酶的二聚化在塑造線粒體cristate中起著重要作用。機械敏感通道通過部分由膜變形施加的機械力控制。

當X射線晶體學是確定結構的主要方法時，解析膜蛋白的結構曾經極具挑戰性。必須從破裂的膜中純化出高度均質的膜蛋白，並用精心選擇的去汙劑取代以結晶。自2013年以來，冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）單顆粒分析（SPA）已成為膜蛋白高解析度結構解析的主流手段。已應用多種試劑將膜蛋白溶解為單個顆粒以進行分析。除了去汙劑微團外，兩親，納米圓盤和苯乙烯-馬來酸脂質顆粒（SMALP）封閉的帶有天然膜的納米圓盤也已用於成功的膜蛋白冷凍-EM結構分析 。

儘管取得了這些進步，但所有上述膜蛋白分離方法都破壞了膜的拓撲結構，即使在SMALP環繞的帶有天然膜片的納米盤的情況下，也消除了任何現有的電化學梯度和膜曲率。為了保留這些重要特性，使用電子冷凍斷層掃描（cryo-ET）的原位結構分析可能是最終的解決方案。然而，當前的技術障礙阻止了使用cryo-ET的高解析度原位結構測定。另一種替代策略是研究嵌入脂質體中膜蛋白的結構，該結構已廣泛用於膜蛋白的功能分析。

儘管使用蛋白脂質體進行了廣泛的功能表徵，但僅有有限的嘗試將這種系統用於膜蛋白的結構闡明。在過去的十年中，已經開發了諸如隨機球形約束（RSC）之類的方法來研究具有改進SPA策略的蛋白脂質體系統。但是，要在兩個報告中執行精確的角度分配或信號減法，目標蛋白脂質體必須是接近完美的球體，這是很難獲得的前提條件。兩種方法都還需要對原始圖像進行額外的預處理步驟。

為了將cryo-EM用於嵌入或附著在脂質體上的膜蛋白的結構分析，有必要為膜蛋白摻入，冷凍樣品製備和cryo-EM數據處理開發高度可重複且方便的工作流程。為此，研究人員選擇了來自大腸桿菌的經過充分研究的耐多藥轉運蛋白AcrB作為方法開發的原型。質子梯度驅動的AcrB是一種三聚體，分子量約為350 kDa。它是即使在低純度和低濃度下也最易於結晶的膜蛋白之一。因此，AcrB的結構是在早期確定的。到目前為止，在蛋白質資料庫（PDB）中使用X射線晶體學和單顆粒冷凍EM方法測定的AcrB結構超過100種，為結構驗證提供了極好的參考。

在這項研究中，報告了一種工作流程，該流程具有優化的脂質體分離，低溫樣品製備，深層二維（2D）分類，用於數據處理。使用該研究的簡化方法，獲得了3.9Å解析度的蛋白脂質體中AcrB的重建。該工作流程可輕鬆推廣到蛋白脂質體中膜蛋白的結構測定中，並為使用蛋白脂質體系統在受控的電化學勢或膜曲率存在下膜蛋白的結構分析奠定基礎。

參考消息：https://doi.org/10.1073/pnas.2009385117

本文轉載自公眾號「iNature」（Plant_ihuman）

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原標題：《【科技前沿】顏寧團隊連續發表5篇Cell/Nature，提出了通用的解析膜蛋白的方法》

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