2020 年結構生物學突飛猛進，取得了令人矚目的成就！
疫情初期，面對新型的冠狀病毒，結構生物學家們爭先恐後的對病毒結構進行了深度解析，一系列的研究成果為後續的抗體檢測、中和抗體、疫苗研發等提供了堅實的結構基礎；
2020 年 10 月，Nature 「背靠背」發表文章，將人們利用冷凍電鏡的觀測精度擴展到了原子解析度級別，高達 1.2 Å 的解析度下，蛋白原子結構清晰可見，與電子密度圖完美契合；
2020 年 12 月，由 Google 旗下 DeepMind 開發的 AI 系統 AlphaFold，在精確預測蛋白質的 3D 結構上取得突破性進展，被譽為半個世紀以來最重要的突破之一。
普林斯頓大學分子生物學系顏寧教授作為活躍在最前沿的結構生物學家，也是最高產的生物學家之一。2021 新年伊始，1 月 5 日顏寧團隊與清華大學尹航團隊即合作在PNAS發表最新的學術論文，藉此機會，丁香學術梳理了近 1 年顏寧團隊主要研究成果，來看看大牛如何玩轉結構生物學的！
2020 年到今日，顏寧教授已發表 10 篇頂刊論文（2 篇Nature, 2 篇Cell, 4 篇PNAS, 1 篇Nature Communications, 1 篇Angewandte Chemie），下面將以時間線來逐一介紹這些高水平文章。
圖片來自：https://molbio.princeton.edu/publications
1. 開發新型製備單層石墨烯膜材料新方法
2020 年 1 月 14 日，顏寧團隊在PNAS發表題為 High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy 的研究論文，該論文開發了一種更方便簡捷的方法來製造高質量的石墨烯冷凍 EM 網格用於單顆粒冷凍 EM 分析。
圖片來自：PNAS
研究團隊通過使用有機分子輔助轉移方法將連續的單層石墨烯從其原始基板銅箔轉移到多孔碳柵格上來製造石墨烯冷凍 EM 柵格。在轉移過程中，通過使用一層薄的甲基丙烯酸甲酯 （MMA） 支撐石墨烯，該方法可以使懸浮的石墨烯非常高地覆蓋孔區域 （高達 99％單層石墨烯覆蓋率） ，允許超過 70％的網格方格有效的數據採集，提高圖像質量和蛋白質密度。
使用該石墨烯網格，實現了分子量小蛋白質的最高解析度 2.6Å（用於抗生蛋白鏈菌素，質量為 52 kDa） 。該方法只採用簡單的工具，並且可針對特定的蛋白質定製 EM 網格。
2. 揭示人源膽固醇醯基轉移酶 (ACAT1) 三維結構及催化機制
2020 年 5 月 13 日，顏寧及黃超蘭團隊在Nature在線發表題為 Structural basis for catalysis and substrate specificity of human ACAT1 的研究論文，該研究介紹了人類 ACAT1 的冷凍電子顯微鏡結構。
膽固醇醯基轉移酶 (ACATs) 催化醯基輔酶 A 的一個醯基基團轉移到膽固醇上，生成膽固醇酯，這是膽固醇在細胞中儲存和在血漿中運輸的主要形式。ACATs 作為潛在的藥物治療目標，如動脈粥樣硬化，阿爾茨海默症和癌症等，已獲得廣泛的關注。
ACAT1 結構顯示每個 protomer 都由九個跨膜段組成，這些跨膜段包圍了一個胞質通道和一個在預計的催化位點會聚的跨膜通道。結構指導的突變分析的證據表明，醯基輔酶 A 通過細胞質通道進入活性位點，而膽固醇可能從側面通過跨膜通道進入。這一結構和生化特徵有助於合理解釋 ACAT1 對不飽和醯基鏈的偏好，並提供對 MBOAT 家族中酶催化機制的見解。
圖片來自：Nature
3. 揭示人源二醯甘油醯基轉移酶 (DGAT1) 三維結構及催化機制
同期，2020 年 5 月 13 日，顏寧及周鳴團隊在Nature在線發表題為 Structure and mechanism of human diacylglycerol O-acyltransferase 1 的研究論文，該工作利用單顆粒冷凍電鏡技術，首次解析了解析度為 3.1Å 人源 DGAT1 的同源二聚體結構，並結合酶活性實驗，確定了醯基輔酶 A（acyl-CoA）在 DGAT1 上的結合位點。
圖片來自：Nature
DGAT1 可以同型二聚體或同型四聚體形式存在，兩種形式具有相似的酶活性。DGAT1 的 N 末端與鄰近的 protomer 相互作用，而這些相互作用是酶促活性所必需的。
本研究中報導了首個人源 DGAT1 同源二聚體結構以及其底物 acyl-CoA 的結合位點，對於針對 DGAT1 靶點抑制劑開發有重要指導作用。另外，DGAT1 的結構也將為 MBOATs 超家族中其他成員的結構及功能研究提供重要的信息。
4. 揭示 Nav 通道的結構和功能機制
NaChBac 是第一個被表徵為電壓門控的 Na+（Nav）通道，已經成為研究 Nav 通道結構與功能關係的原核原型。近二十年來，NaChBac 的結構解析尚無大的進展。
2020 年 6 月 8 日，顏寧團隊在PNAS在線發表題為 Employing NaChBac for cryo-EM analysis of toxin action on voltage-gated Na+ channels in nanodisc 的研究論文，該研究介紹在洗滌劑膠束和納米圓盤中 NaChBac 的單粒子冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）分析。
在兩種條件下，NaChBac 的構象與潛在滅活的 NavAb 的構象幾乎相同。確定納米光碟中 NaChBac 的結構使研究人員能夠檢查脂質雙層中Nav 通道的門控修飾劑毒素（GMT） 。
為了研究哺乳動物 Nav 通道中的 GMT，該研究生成了一個嵌合體，其中 Nav1.7 的第二個電壓感測域中 S3 和 S4 區段的細胞外片段替換了 NaChBac 中的相應序列。單獨和與 HuwenToxin IV （HWTX-IV） 配合使用的納米盤嵌入嵌合體的 Cryo-EM 結構分別確定為 3.5Å 和 3.2Å 解析度。
與 HWTX-IV 結合的人 Nav1.7 的結構相比，該結構的總解析度為 3.2Å，毒素的局部解析度已從約 6Å 提升到了約 4Å。此解決方案可實現毒素對接的可視化。因此，NaChBac 可以用作膜環境中 GMT 與 Nav 通道之間相互作用的結構研究的便捷替代品。
圖片來自：PNAS
5. 首次解析 NPC1/2 複合物結構，揭示膽固醇分子「轉運旅程」
溶酶體膽固醇的排出需要兩種蛋白質 NPC1 和 NPC2，其缺陷是造成 C 型 Niemann-Pick 疾病的原因。
2020 年 6 月 15 日，顏寧及楊洪遠團隊在Cell在線發表題為 Structural Basis of Low-pH-Dependent Lysosomal Cholesterol Egress by NPC1 and NPC2 的研究論文，該研究揭示了低 pH 依賴性膽固醇從 NPC2 傳遞到 NPC1 跨膜（TM）域的分子基礎。
在 pH 8.0 時，在納米光碟和去汙劑中分別獲得 3.6Å 和 3.0Å 解析度的 NPC1 類似結構，揭示了連接 N 端結構域 （NTD） 和跨膽固醇傳感結構域 （SSD） 的隧道結構；在 pH 5.5 時，NTD 表現出兩個構象，表明膽固醇向隧道輸送的運動。在通道的膜邊界發現了一個假定的膽固醇分子，TM2 向 SSD 上的表面袋形成。最後，在 pH 5.5 時獲得了解析度為 4.0 的 NPC1-NPC2 複合物的結構，闡明了膽固醇從 NPC2 轉移到 NPC1 （NTD） 的分子基礎。
圖片來自：Cell
6. 設計新型膜蛋白研究流程，助力膜蛋白結構研究
2020 年 7 月 17 日，顏寧團隊在PNAS發表題為 Cryo-EM analysis of a membrane protein embedded in the liposome 的研究成果。本篇文章通過對蛋白質脂質體製備條件優化，石墨烯載網篩選及深度 2D 分類，設計了一個利用冷凍電鏡技術對於嵌入脂質體中高分辨膜蛋白結構分析的完整工作流程，為膜蛋白結構和功能的研究提供了思路。
本篇文章設計了一個利用冷凍電鏡技術對於嵌入脂質體中高分辨膜蛋白結構分析的完整工作流程。該流程包含：蛋白質脂質體準備過程的優化 （樣品製備過程中的去垢劑，脂質體，脂質體分離等） ，選取高質量的石墨烯載網，及深度的 2D 分類 （多步 2D 分類的方法除去不好的顆粒） 。
總之，作者為我們接下來進行膜蛋白結構和功能的研究提供了很好的思路和解決方法。
圖片來自：PNAS
7. 聚焦瘧原蟲糖轉運蛋白，助力開發新型抗瘧藥物
2020 年 8 月 28 日，顏寧團隊與清華大學尹航團隊合作在Cell上在線發表題為 Structural Basis for Blocking Sugar Uptake into the Malaria Parasite Plasmodium falciparum （抑制惡性瘧原蟲糖攝入的結構基礎） 的重要研究成果。
該論文報導了PfHT1 分別結合天然底物葡萄糖和一個已知的選擇性與抑制效果都比較微弱的抑制劑 C3361 的兩個結構。出乎意料，C3361 的結合導致了 PfHT1 巨大的構象變化，衍生出一個全新的空腔結構，可以用來作為靶點進行抑制劑的設計與優化。
在此發現的基礎上，團隊成員開發出了一系列具有更高親和力的選擇性抑制劑，在原蟲抑制實驗中確認可以有效殺死瘧原蟲，卻對人源細胞無害，從而為開發新一代抗瘧藥物開闢了道路。
圖片來自：Cell
8. 二氫吡啶化合物調控電壓門控鈣離子通道 Cav1.1 的機制
2020 年 10 月 30 日，顏寧團隊在Angewandte Chemie上在線發表了 Structural Basis of the Modulation of the Voltage-Gated Calcium Ion Channel Cav1.1 by Dihydropyridine Compounds*。
1,4 - 二氫吡啶 (DHP) 是最常用的抗高血壓藥，通過抑制 L 型電壓門控 Ca2+(Cav) 通道發揮作用。DHP 化合物表現出手性特異性的拮抗或激動作用。兔源 Cav1.1 與非手性藥物硝苯地平結合的結構揭示了 DHP 藥物的一般結合模式，但手性特異性的分子基礎仍然未知。
該研究報告了納米盤包埋 Cav1.1 在暢銷藥物氨氯地平 （amlodipine） 、DHP 拮抗劑 (R)-(+)-Bay K8644 和其激動劑 (S)-(-)-Bay K8644 冷凍電鏡結構，解析度為 2.9-3.4 Å，氨氯地平結合的結構揭示了該藥高療效的分子基礎。
圖片來自：Angewandte Chemie
9. 揭示人源 Ferroportin（鐵轉運蛋白）中離子轉運和抑制的結構和機制
2020 年 11 月 10 日，顏寧及周鳴團隊在Nature Communication在線發表題為 Structural basis of ion transport and inhibition in ferroportin 的研究論文，該研究介紹了人類的 Ferroportin（鐵轉運蛋白）冷凍電子顯微鏡結構。
Ferroportin 是一種鐵輸出劑，對釋放細胞鐵進入循環至關重要。鐵轉運蛋白被一種肽類激素 hepcidin （鐵調素） 所抑制。在人類中，鐵轉運蛋白的突變會導致鐵轉運蛋白疾病，通常與巨噬細胞中鐵的積累和缺鐵性貧血的症狀有關。
該研究解析了來自靈長類眼鏡猴 （TsFpn） 的鐵轉運蛋白在存在和不存在鐵調素的情況下的結構。TsFpn 由兩個類似於蚌殼的域組成，該結構定義了兩個金屬離子結合位點，每個結構域有一個。兩種結構都是朝外的構象，肝素在兩個域之間結合併到達其中一個離子結合位點。
這些結果奠定了鐵運素金屬離子結合、轉運和抑制的結構基礎，為鐵運素疾病的藥理學幹預中的靶向研究提供了藍圖。
圖片來自：Nature Communications
10. PfHT1 抑制劑新型抗瘧藥物的研發
2021 年 1 月 5 日，清華大學藥學院尹航團隊與顏寧團隊合作，共同通訊在 PNAS 在線發表題為 Orthosteric-allosteric dual inhibitors of PfHT1 as selective anti-malarial agents 的研究論文，該研究通過抑制惡性瘧原蟲中唯一的己糖轉運蛋白 - 惡性瘧原蟲己糖轉運蛋白 1 （PfHT1） ，開發了一種「選擇性飢餓」策略，提供了一種對抗多種藥物瘧原蟲的方法。
圖片來自：PNAS
該研究設計了小分子以同時阻斷 PfHT1 的正構和變構口袋。通過廣泛的結構 - 活性關係研究，TH-PF 系列被鑑定對多種血階段惡性瘧原蟲具有有效的作用。
該系列化合物對紅內期瘧原蟲各亞期都有良好的抑制效果，且與現有抗瘧藥物（雙氫青蒿素）表現出不同的作用模式，這代表著一種新型抗瘧藥物的研發思路，從而為該系列抗瘧藥物的進一步開發奠定了基礎。
正像顏寧老師所說，技術應該服務於探索。
結構生物學遠不止單純的分子的拼裝，而是首重生物學的發現，是科學家理解生命 / 認識世界的一種手段。
新的一年，讓我們一起去發現！
PNAS | 顏寧又出新作！設計新型膜蛋白研究流程，助力膜蛋白結構研究
論文連結：
1. DOI: 10.1073/pnas.1919114117
2. DOI: 10.1038/s41586-020-2290-0
3. DOI: 10.1038/s41586-020-2280-2
4. DOI: 10.1073/pnas.1922903117
5. DOI: 10.1016/j.cell.2020.05.020
6. DOI: 10.1073/pnas.2009385117
7. DOI: 10.1016/j.cell.2020.08.015
8. DOI: 10.1002/anie.202011793
9. DOI: 10.1038/s41467-020-19458-6
10. https://doi.org/10.1073/pnas.2017749118
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