細胞全能性和多能性是植物再生的細胞學基礎. 2005年, Science雜誌公布了125個最具挑戰性的科學問題, 其中植物細胞全能性被列為最重要的25個科學問題之一. 植物體細胞的命運如何在激素作用下進行重編程, 通過細胞分裂和分化發育成為一個獨立的植株或器官是建立植物高效再生方法的理論基礎. 植物再生技術的發展和基因組編輯技術的應用將引領作物分子育種技術的變革, 培育出更多高產、多抗、環境友好的未來作物, 助推世界農業的可持續發展.
今天給大家推薦發表在中國科學生命科學的重磅綜述文章《植物細胞全能性和再生》，該綜述論文由許智宏 , 張憲省, 蘇英華, 胡玉欣 , 徐麟 以及王佳偉老師合作完成。本文回顧了新中國成立70年以來我國在植物組織培養和細胞全能性領域的研究成果和發展歷程, 通過總結國內外最新的研究進展提出本領域亟需回答的重要科學問題以及學科將來的發展方向.再生(regeneration)是指生物體的組織或器官在受損或脅迫後自我修復或替換的過程. 在動物中, 如水螅、渦蟲、棘皮動物(海星、海百合)等物種將其身體部分切割後, 都能在傷口處再生出完整的形態. 植物也具有強大的再生能力, 例如, 園藝上廣為應用的扦插繁殖、很多植物地下根切段上和離體葉柄基部芽的再生; 在樹冠修剪後, 樹木受傷的枝條可以再生不定芽, 發育為新的樹冠等.
1 植物細胞全能性的發現
生物體再生的細胞學基礎在於細胞全能性(totipotency)和多能性(pluripotency). 1902年, 德國著名植物生理學家Haberlandt[1]根據細胞學說, 大膽地提出了「細胞全能性」概念. 他預測, 植物體細胞具有可以在體外培養後脫分化並發育成完整植株的能力, 為植物細胞全能性的誘導研究奠定了理論基礎. Haberlandt將高等植物的各類組織細胞在培養基上進行離體培養, 最終發現, 有些細胞能夠增大, 卻始終沒有看到細胞分裂和增殖.
1939年, White和Nobécourt首次觀察到植物組織培養過程中芽和根的發生. 3年後, Gautheret[2,3]在組織培養過程中得到了榆樹的幼芽和菊苣的幼苗. 1947年, Levine[4]發現, 在胡蘿蔔組織培養中移除生長素可以誘導芽的產生. 在White實驗的基礎上, Skoog[5]發現, 當菸草組織在固體培養基上培養時會產生不規則的生長, 而當菸草組織被浸沒在液體培養基內時會誘導芽的發生. 隨後, Skoog和Tsui(崔澂)[6]一起發現腺嘌呤(adenine)可以促進菸草莖外植體的細胞分裂, 芽和根的發生是由培養基中腺嘌呤和生長素的平衡決定的. 1955年, 激動素(kinetin, 一種細胞分裂素的類似物)被發現. 1957年, Skoog和Miller[7]在此基礎上發現, 激動素可以有效地促進外植體的細胞分裂和芽再生. 尤為重要的是, 他們發現, 高激動素/生長素比例誘導芽的發生而低激動素/生長素比例促進根的發生. 這一發現奠定了植物組織培養中再生和細胞工程的基礎, 揭開了激素調控植物器官再生的秘密面紗.
為了證實Haberlandt提出的植物細胞全能性假說, 需要證明單個植物細胞可以分裂, 同時這個細胞可以通過細胞分裂與分化形成一個完整的植株. 1954年, Muir等人[8]利用萬壽菊愈傷組織建立了植物細胞懸浮系. 他們通過愈傷組織哺育方法(nurse culture method)成功地觀察到單個細胞可以分裂形成小的細胞團. 1958年, Steward等人[9]將胡蘿蔔根韌皮部的細胞進行離體培養, 發現這些細胞失去已分化細胞的結構特徵並發生反覆的細胞分裂, 最終形成胚胎並發育成具有根、莖、葉等器官的完整植株. 同年, 德國科學家Reinert[10,11]也獲得了類似的研究結果. 此後科學家們經過50餘年的不斷實驗, 至今植物細胞的全能性已經得到充分驗證. 然而植物體細胞如何啟動重編程重新獲得細胞分裂的能力, 進而表達全能性的分子機理目前仍不清楚. 2005年, Science雜誌在慶祝其創刊125周年之際, 公布了125個最具挑戰性的科學問題. 其中植物細胞全能性被列為最重要的25個科學問題之一[12].
2 植物細胞全能性的基本概念
隨著分子生物學和細胞生物學理論的發展, 細胞的多能性、全能性和再生已經逐漸從一個自然現象發展為再生醫學和植物細胞工程的理論基礎. 在動物領域, 體細胞可以在多個轉錄因子的誘導下重編程, 成為具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的幹細胞(stem cell), 進而發育形成新的器官和組織; 在植物領域, 離體培養的植物組織和細胞也可以在植物激素的誘導下再生出新的器官或一棵完整的植株.
高等植物的器官起源於莖端分生組織(shoot apical meristem, SAM)、根端分生組織(root apical meristem, RAM)和側生分生組織(lateral meristem). 存在於分生組織的幹細胞既可以通過細胞分裂維持自身細胞群的大小, 同時又可以進一步分化成為各種不同組織或者器官的細胞, 從而構成機體各種複雜的組織器官. 因此, 它們是高等植物組織器官產生的來源, 是植物發育無限性的細胞學基礎[13]. 由於分生組織幹細胞受到來源於周圍已分化成組織形成的微環境信號的調控, 它們只能分化各種器官而不能形成完整植株, 因此被認為是具有多能性的植物幹細胞[14]. 除植株的分生組織幹細胞能夠表現植物細胞的多能性而分化產生器官外, 在脅迫、創傷或激素處理等離體培養條件下也能誘導產生新的植物組織或器官, 實現植物細胞多能性的離體誘導[15].
植物細胞在一定條件下也能表現出細胞全能性, 即單個植物細胞具有能夠發育成為完整植株的潛在能力. 在高等植物的有性生殖過程中, 兩個單倍體的配子(卵細胞和精細胞)融合後形成二倍體的單細胞受精卵, 並繼續發育成胚胎, 最終形成完整的新植株. 因此, 單細胞受精卵具有發育成完整植株的能力, 是植物中典型的全能性細胞. 在自然界中, 許多特殊的植物能夠在卵細胞未受精的情況下產生胚胎, 即無融合生殖現象. 在無融合生殖植物中, 胚胎可以由胚珠孢子體組織或未退化的配子體細胞直接發育而成[16]. 還有一些植物, 如落地生根等可以在葉子的邊緣通過器官發生和體胚再生的協同過程形成不定胚, 然後通過胚胎發生完成植株發育[17]. 除此之外, 植株上大多數組織和器官的體細胞只能表現一定的形態和生理功能, 這是因為它們受控於其所在植株部位的特定生長發育環境. 而當它們一旦脫離植株而處在離體狀態、失去特定發育環境條件的制約, 在一定的條件下, 如脅迫、創傷或激素等外界條件刺激, 植物體細胞就會進入重編程過程, 進而表現出細胞全能性.
高等植物的再生可分為以下三種: 組織修復(tissue repair); 器官從頭再生, 包括根從頭再生(de novo root regeneration)和芽從頭再生(de novo shoot regeneration); 體細胞胚再生(somatic embryogenesis)(圖1). 組織修復是指組織或器官在損傷或缺失後, 可以修復或重新生長出能夠替代原來組織器官行使功能的結構. 根和芽的從頭再生是指受傷或離體的植物組織長出不定根或不定芽的過程[18]. 器官從頭再生是植物再生的重要方式, 與體細胞胚再生不同, 植物器官從頭再生的過程僅需誘導外植體(explant, 即離體組織或器官)形成SAM和RAM, 無需經過類似胚胎發育的過程. 體細胞胚再生是指已分化的體細胞在一定條件下脫分化獲得分生能力, 經過類似胚胎發育的過程形成完整植株[19].
3 我國在植物組織培養和細胞全能性領域的歷史貢獻20世紀30~40年代, 李繼侗、羅宗洛、崔澂和羅士韋等教授開展了一系列植物組織培養工作. 1934年, 李繼侗和沈同[20]發表的「銀杏胚在體外的發生」「泛酸對酵母生長及銀杏胚根在人工培養基中生長的效應」等文章是我國植物組織培養和器官培養的開端. 這些文章首次報導了銀杏胚乳中存在促進胚胎在體外培養基上生長發育的未知物質. 受此研究成果的啟發, van Overbeek等人[21]在1941年發現, 椰奶(液態的胚乳)可以促進幼嫩曼陀羅胚胎的生長和發育, 並最終奠定了細胞激動素的發現基礎. 1942年, 羅宗洛和羅士韋[22]研究了氮源對玉米離體根尖生長的影響. 1943年, 羅士韋和王伏雄[23]在世界上首次實現了裸子植物的胚胎體外培養. 此後, 羅士韋又建立了植物莖尖離體培養技術, 成功地利用該技術使菟絲子在試管中長成植株並開花, 開創性地將組織培養技術應用於實驗研究.
20世紀50~60年代, 國內開展植物組織和細胞培養工作的研究機構不多, 科研人員主要從事一些基礎性研究並試圖與實際應用相結合. 例如, 中國科學院上海植物生理研究所羅士韋實驗室開展了植物激素與愈傷組織生長以及人參等藥用植物組織培養的工作; 中國科學院植物研究所王伏雄實驗室系統性地開展了植物幼胚培養工作; 北京大學曹宗巽實驗室通過建立黃瓜體外莖尖培養的方法, 研究乙烯等激素對雌雄花性別決定的影響; 北京大學李正理實驗室利用胚培養研究胚根頂端縱切對根形態發生的影響. 此外, 還有一些育種機構嘗試利用胚胎挽救(embryo rescue)方法進行遠緣雜交以獲得雜種, 並開展馬鈴薯脫毒苗的前期研究工作. 令人遺憾的是, 植物組織培養工作在當時特殊的歷史時期下, 時斷時續.
1964年, Guha和Maheshwari[24]建立了毛葉曼陀羅的花葯培養體系, 並觀察到類似胚胎狀結構的產生. 在此基礎上, 他們於1966年成功獲得了毛葉曼陀羅單倍體植株[25]. 這兩項工作為今後的花葯培養和單倍體育種工作奠定了基礎. 1967年, Bourgin和Nitsch[26]利用類似的體系實現了菸草的單倍體誘導. 1968年, Niizeke和Oono[27]首次實現了通過花粉培養體系誘導形成單倍體穀類作物. 由於單倍體可以用於育種, 因此這一方面的工作在「文化大革命」這一特殊時期下得到蓬勃發展. 中國科學院遺傳研究所、中國科學院植物研究所、中國農業科學研究院等單位在20世紀70年代早期便開展了相關研究, 最多時, 國內有數百家單位開展類似的工作, 形成了單倍體育種的研究熱潮. 我國學者對水稻、小麥、玉米等禾穀類作物, 油菜和多種蔬萊的花葯培養做了系統的工作, 並培育出一系列花培品種和品系. 值得一提的是, 中國科學院植物研究所朱至清和孫敬三等人[28,29]發現, 低氨和過濾除菌的葡萄糖對水稻花粉的愈傷組織形成和體細胞胚發生具有促進作用, 並在此基礎上成功研製了適合小麥花葯培養的N6培養基, 這一培養基現已廣泛用於禾穀類作物組織培養中.
1960年, 英國諾丁漢大學科學家Cocking[30]首次利用纖維素酶酶解的方法獲得了番茄幼苗根的原生質體. 此後10年, 商業化的纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶也逐漸發展成熟. 20世紀70年代中後期, 中國科學院植物研究所、中國科學院遺傳研究所、中國科學院上海植物生理研究所、蘭州大學、山東大學等科研院所和高校開始開展植物原生質體培養和體細胞雜交工作. 除了摸索與建立原生質體培養體系外, 還希望以原生質體為受體導入外源DNA/基因, 或通過體細胞雜交, 獲得一些重要農作物的雜種. 在這一方面, 我國科學家做出了一系列出色的工作. 一批重要農作物, 包括水稻、小麥、玉米、高粱、穀子等禾穀類作物, 重要豆科植物大豆、花生和蠶豆, 以及多種果樹和林木, 通過原生質體培養獲得了再生植株[31,32].
利用植物莖尖離體培養(shoot tip culture)方法生產脫毒苗也是20世紀70年代我國植物組織培養和細胞工程研究的重要方向. 脫毒苗在應用上最成功的首推馬鈴薯, 在其他塊根塊莖類植物如薯蕷、甘薯和中藥懷地黃, 以及無性繁殖的果蔬類植物如香蕉和草莓等也取得了良好的效果, 增產效果顯著. 廣東省開展了利用組織培養技術創製無毒香蕉品系的研究, 取得了良好的經濟和社會效益. 此外, 國內一些研究單位開始研究和推廣植物組織培養快繁技術, 實現了規模化生產. 試管苗在蘭花、康乃馨、香石竹等花卉快繁中得到廣泛應用. 值得一提的是, 廣西和河北還開展了大規模的桉樹和楊樹試管苗快繁技術的研究, 為保障我國木材自給做出了重要的貢獻.
1964年起, 利用植物細胞培養生產具有藥用價值的植物次生代謝化合物成為國內植物組織培養領域的一個重要研究領域. 中國科學院植物研究所葉和春實驗室在這一領域取得多項重要研究成果. 其中「新疆紫草細胞大量培養生產紫草寧衍生物」的研究成果經專家鑑定, 認為該成果達國際先進水平. 1978年, 中國科學院昆明植物研究所實現了三分三(Scopolia acutancula)、三七(Panax notogenseng)和蘿芙木(Rauwolfia yunnanensis)等三種藥用植物的愈傷組織培養. 這些愈傷組織均保留了藥用生物鹼的生物合成能力.
總之, 花葯培養和單倍體育種、原生質體培養和體細胞雜交、脫毒和快繁技術以及植物細胞的次生代謝工程工作為我國培養了一大批優秀科研人才, 積累了大量的植物組織培養的技術和經驗. 在這些應用性基礎研究中還發現了許多有趣的生命現象. 這些為改革開放後我國在植物組織培養和細胞全能性領域的快速發展奠定了堅實的基礎.
4 改革開放後我國植物組織和細胞培養領域的發展歷程
1978年, 「中澳植物組織培養」國際會議是「文化大革命」後中國科學院組織的一次大型國際會議. 本次會議促進了中外學術交流, 也讓國外科學家了解到中國科學家在植物培養和細胞工程領域的工作. 1978年8月, 第四屆國際植物組織細胞培養會議在加拿大卡加立(Calgary)大學召開, 共有來自42個國家的550多名科學家參會. 中國科學院派出8名中國科學家代表中國首次參加了這個會議. 中國科學院遺傳研究所所長胡含在會上作了「中國花葯培養的部分研究工作」的報告, 引起了與會科學家的重視與興趣. 至此, 我國植物組織和細胞培養研究迎來了一個嶄新的發展期, 研究重心逐漸從應用研究轉向基礎理論研究. 同年, 上海科技出版社出版了由中國科學院上海植物生理研究所細胞生理研究室編譯的《植物組織和細胞培養》一書(圖2). 該書全面系統地介紹了植物組織和細胞培養的發展歷史、原理基礎、操作技術、應用範圍和存在問題, 在當時我國資料極度欠缺的情況下, 為從事植物組織培養工作的科研人員及從事實際應用的工作人員提供了重要的學習和研究的基本教材.
20世紀80年代, 分子生物學和遺傳工程的興起推動了國際相關領域研究的快速發展. 國內的一些實驗室逐步通過建立穩定的植物組織培養和再生體系, 開展了一些重要植物發育和生理過程的研究. 例如, 中國科學院上海植物生理研究所許智宏和衛志明實驗室[33~35]開展了激素調控外植體器官發生的研究, 發現了生長素極性運輸對胚胎形態建成的影響. 中國科學院植物研究所陸文樑實驗室[36]利用風信子球莖鱗片外植體培養體系, 在試管中實現了植物生殖器官的重新發生. 值得一提的是, 我國學者還先後通過柑橘、獼猴桃、水稻、枸杞等植物的胚乳培養, 獲得了三倍體植株, 證明了胚乳三倍體細胞的全能性[37~40]. 此外, 利用原生質體融合結合組織培養再生成為作物育種的一個新興研究方向, 出現了一大批體細胞雜種作物[41].
1990年, 許智宏組織召開了國內第一次以「植物發育調控機理的研究」為主題的香山會議. 會議邀請了一批國內從事這方面研究的專家以及不少剛從海外留學歸國的青年學者參會. 本次會議推動了國內有關植物發育生物學和植物激素的研究, 也促進了將遺傳學和分子生物學的理念和技術引入植物組織培養中關於器官形成和胚胎發生的研究.
2002年, 在美國奧蘭多(Orlando)召開的第10屆國際植物組織培養與生物技術大會上, 許智宏當選國際植物組織培養和生物技術聯合會主席(2002~2006). 2006年, 在北京召開的第11屆國際植物組織培養與生物技術大會上, 通過了由Vasil教授提議的將「國際植物組織培養和生物技術聯合會」更名為「國際植物生物技術聯合會」(International Association for Plant Biotechnology, IAPB)的動議. 這樣, 從最早的國際植物組織培養協會, 到後來1998年在以色列耶路撒冷(Jerusalem)召開的第9屆國際植物組織和細胞培養大會上改名為國際植物組織培養和生物技術聯合會, 再到2006年北京會議上正式改名為國際植物生物技術聯合會, 反映了21世紀植物組織培養和細胞工程這一領域研究工作的發展趨勢.
2007年科技部啟動了「植物幹細胞維持和分化的分子機理研究」重大研究計劃項目. 該項目圍繞「植物幹細胞維持、分化和功能獲得的分子機制」這一關鍵科學問題開展研究, 旨在解析植物幹細胞維持、細胞分化、器官發生和花期控制和環境信號響應的遺傳和表觀遺傳學基礎以及高等植物細胞全能性的分子機理. 在此基礎上, 科技部於2013年又資助了「微環境調控植物生長點幹細胞中心維持與重建的分子網絡」項目. 該項目圍繞「微環境調控植物生長點幹細胞中心維持與重建的分子機制」這一關鍵科學問題, 利用模式植物擬南芥和水稻豐富的遺傳資源和基因組學信息, 結合活體和離體研究體系及現代生物學技術手段, 進一步系統地解析了植物生長點幹細胞微環境調控幹細胞中心維持和重建的分子網絡.
2013年, 基於CRISPR-Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins 9)技術的新一代基因組編輯技術開始興起. 在過去的6年時間裡, 植物基因組編輯體系已經逐漸發展成熟, 建立了從DNA片段的缺失、單鹼基替換到長片段敲入(knockin)等一系列基因編輯技術體系. 然而隨著這些技術手段的快速發展, 高效廣譜植物再生體系匱乏的瓶頸效應日益凸顯. 直到今日, 許多農作物(如大豆)的轉化效率低下, 水稻、玉米、小麥和棉花等重要農作物的轉化具有很強的品種特異性. 在此背景下, 2016年中國科學院啟動了「植物特化形狀形成及定向發育調控」戰略先導B項目, 將「植物細胞全能性和再生的分子機理」作為重要課題進行攻關.
5 植物再生現象的機制和應用5.1 嫁接與組織修復
嫁接是一種重要的營養繁殖技術. 為了獲得不同植物體各部位優良性狀的整合, 可以將一種植物的枝幹或芽(稱為接穗)嫁接到另一種植物的莖或根(稱為砧木)上, 並使這兩部分生長為一個植株. 這一技術在果樹、瓜果等生產中被廣泛使用.
嫁接的原理主要是基於植物具有組織修復這一再生能力. 植物的莖稈、根尖、葉尖等部位都可以在受損後進行修補. 很多實驗室利用根尖切除或雷射打擊實驗證實, 在已部分分化的根尖細胞中可以利用生長素和傷口信號激活幹細胞的程序來修復根端分生組織[42~48]. 在莖稈的傷口處, 生長素、乙稀、茉莉素和赤黴素等植物激素共同作用, 通過激活關鍵的轉錄因子基因(比如NAC家族和AP2/ERF家族基因)來修復受損的部位[49~52]. 在模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)的研究中, 發現了一類被傷口激活的基因WOUND INDUCED DEDIFFERENTIATION(WIND), 它們編碼AP2/ERF類轉錄因子, 能夠參與到多條植物傷口誘導的再生通路中[53~55]. 最近的研究發現, 茉莉素等激素可能是植物傷口釋放的信號, 用於啟動再生過程[46,47]. 這些對植物傷口促進再生的研究奠定了組織修復領域的基礎.
在嫁接中, 接穗和砧木之間維管組織的修復及連接是最關鍵的一步. 利用模式植物擬南芥的下胚軸進行嫁接實驗發現, 生長素和細胞分裂素等激素都參與了這個修復過程[56,57]. 生長素可能通過ABERRANT LATERAL ROOT FORMATION 4(ALF4)基因來控制修復過程. 通過轉錄組數據分析發現, 維管組織發育相關的基因、激素響應基因、糖響應基因等都在接穗和砧木之間呈現出不對稱表達, 說明整個修復過程中接穗和砧木起到的作用並不相同[57]. 另外, WIND等響應傷口的基因也可能對修復有作用[53,57].
雖然人們對植物嫁接的生理和分子研究有一些進展, 但目前對於控制嫁接中組織修復的整個分子框架構建還不完善, 控制組織修復的關鍵基因也有待於進一步發現. 有些有趣的問題也很值得探索, 比如親緣關係比較遠的植物為什麼難以嫁接, 嫁接後接穗和砧木之間的物質如何交流等. 有實驗報導, 在不同物種進行嫁接後可能會發生細胞核內的遺傳物質交流, 通過核內染色體異源多倍化形成新物種, 為農業育種提供了新的方法[58].
5.2 扦插與根從頭再生扦插是將植物根從頭再生的能力應用到農藝生產中的實例. 離體的枝條、葉片等都可以作為扦插的材料進行營養繁殖(圖3A和B). 對於扦插的生理現象研究有很長的歷史[59]. 隨著對植物激素生長素的研究, 人們認識到生長素是根從頭再生的核心激素. 在20世紀30年代生長素的化學本質吲哚乙酸被揭示後, 科學家們就發現, 生長素和其人工合成的類似物, 比如α-萘乙酸(α-naphthaleneacetic acid, NAA)和3-吲哚丁酸(indole-3-butyric acid, IBA), 都可以促進扦插中髮根現象的發生[60~62]. 因此, 人工合成的生長素類似物通常是髮根粉的主要成分.
隨後, 人們建立了很多模式植物的扦插體系用於研究根從頭再生過程, 比如在矮牽牛(Petunia hybrida)[63]和擬南芥[64~66]中的各種不定根再生體系. 基於這些研究體系, 人們可以從生理、細胞和分子角度, 對扦插過程中的再生現象進行研究. 擬南芥離體葉片再生不定根是研究根從頭再生的一個很方便實用的體系[66]. 將擬南芥的葉片剪下後, 放在不含任何外源激素的培養基上, 葉片可以自發再生出不定根(圖3B). 由於擬南芥具有突出的遺傳學、細胞學和分子生物學的研究優勢, 因此對於推動扦插技術的機制研究有很大的幫助.
現有的研究可以將扦插中再生不定根的過程歸納為三個連續的階段[67](圖3C): 第一階段中, 剛剪下的外植體(如莖段或葉片)會感受傷口和環境等上遊信號; 第二階段中, 這些上遊信號會在葉肉、維管等細胞中指導生長素的合成, 然後生長素被極性運輸到傷口附近的形成層等幹細胞中; 第三階段中, 傷口附近的形成層等幹細胞在高濃度生長素指導下進行細胞命運的轉變, 形成不定根. 因此整個過程需要兩大類細胞的協同工作: 第一類是葉肉、維管等細胞, 它們負責合成生長素; 第二類是形成層等幹細胞, 它們能夠轉變命運, 通過細胞分裂形成不定根. 本文以擬南芥離體葉片再生不定根為例, 描述三個階段的詳細過程.
在第一階段, 離體的莖段或葉片需要感知一系列複雜的上遊信號, 比如傷口信號、環境信號、自身的發育狀態等. 傷口是再生的重要啟動因素. 在扦插中, 傷口扮演多個角色. 首先, 傷口產生了一個物理屏障, 阻止離體組織和母體之間的物質交流(比如激素、糖類、代謝產物等). 其次, 傷口還釋放了很多信號, 用於提醒離體組織調動再生程序. 目前對於激活再生的傷口信號知之甚少. 一些物理和化學變化可能是最早的傷口信號, 比如膜電勢、ROS(reactive oxygen species)和鈣離子的變化; 隨後很多激素被調動起來行使傷口信號的傳遞作用, 比如茉莉素和乙稀. 在矮牽牛的扦插過程中, 茉莉素會被傷口快速調動並促進生長素的產生[63,68]. 在擬南芥的離體葉片再生不定根過程中, 茉莉素也起到了傷口信號的作用[46]. 茉莉素可以在擬南芥葉片剪下後10 min內快速在葉片中積累, 並激活ETHYLENE RESPONSE FACTOR 109(ERF109)轉錄因子基因的表達; 隨後, ERF109可以在傷口產生2小時內激活生長素合成通路基因ANTHRANILATE SYNTHASE α1(ASA1). 因此茉莉素作為傷口激素, 將傷口信號轉換成了生長素的合成信號, 從而促進葉片再生不定根. 環境信號對於扦插的效率也很重要. 比如在擬南芥離體葉片再生不定根時, 黑暗環境可以通過激活生長素合成通路基因YUCCA5/8/9(YUC5/8/9)來促進生長素的產生, 從而提高再生效率[69]. 發育狀態也影響離體的莖段和葉片的再生效率. 比如幼嫩的擬南芥葉片比成熟葉片更容易再生不定根[70]; 處於相變前期年齡的葉片也比後期年齡的葉片容易再生不定根[71~73]. 因此總體來說, 傷口信號、環境信號、發育狀態等各種上遊信號是扦插中不定根再生效率的關鍵因素, 也是人為調整再生效率的重要入手點.
在第二階段, 各上遊信號會促使葉肉細胞、維管細胞等合成生長素, 隨後生長素會被極性運輸到傷口附近的幹細胞中. 生長素是根再生的核心激素, 它是使幹細胞命運轉變的主要推動者. 阻止生長素的合成、極性運輸或信號轉導, 都會阻斷整個再生過程. 有趣的是, 生長素的極性運輸是有方向的, 總是從生物學上端運往生物學下端. 因此不定根通常都是在生物學下端的傷口處再生出來. 但目前並不知道生長素極性運輸的方向是何時決定的, 也不知道其決定的具體機制.
在第三階段中, 匯集在傷口處形成層等幹細胞的生長素促發了細胞命運轉變, 產生不定根. 從形成層等幹細胞最終形成不定根的過程, 大致可以分成四個命運轉變的步驟. 第一步是從形成層等幹細胞命運轉變為不定根創始細胞(adventitious root founder cell). 生長素通過信號轉導可以直接激活WUSCHEL RELATED HOMEOBOX 11(WOX11)在不定根創始細胞中表達, 啟動根發育的程序. 突變WOX11將導致再生不定根能力減弱, 而過表達WOX11可以促進再生不定根[74]. 第二步是從不定根創始細胞命運轉變為根原基細胞. 此時根創始細胞開始分裂, 形成一個穹頂狀的根原基細胞團. 在這一步中, WOX11可以激活WOX5/7和LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN16(LBD16)的表達. WOX5/7和LBD16的共表達是根原基特徵的分子標記, 它們的突變都會導致葉片再生不定根能力的缺陷[75]. 第三步是根原基分化成為根端分生組織的過程. 此時LBD16將退出表達, 而WOX5/7將被逐漸限制在根端幹細胞微環境區域[75]. 第四步是成熟根尖的形成及頂出葉片的過程[76]. 經歷了這四步的命運轉變, 葉片再生不定根的過程就基本完成了.
扦插技術雖然應用已久, 但人們對於上遊信號、生長素的產生和運輸以及細胞命運轉變的分子調控機制的了解還很有限. 了解這些關鍵分子的作用機制後, 它們都有可能成為提高再生效率的工具, 應用於現代農業技術.
5.3 植物愈傷組織形成和芽從頭再生的分子調控
愈傷組織(callus)指植物體受到外界損傷、病蟲害侵染等時在損傷部位形成的不規則的細胞團, 而在植物的離體再生體系中, 離體組織或器官可通過植物激素的誘導定向形成具有再生能力的細胞團也被稱為愈傷組織. 愈傷組織誘導一直被認為是細胞脫分化獲得全能性的過程. 早期利用菸草原生質體誘導愈傷組織, 發現在該過程中染色體會發生兩輪解聚, 並伴隨著異染色質蛋白HP1蛋白的重新分布, 組蛋白H3, H9和H14乙醯化水平增加以及編碼核糖體RNA的基因甲基化水平降低[77]. 此外端粒的長度、端粒酶的活性也隨著細胞壁的解離發生改變[78,79]. 擬南芥的愈傷組織細胞與已分化的細胞相比, 異染色質也發生了大規模解聚和重新排布[80]. 通過轉錄組學分析發現, 擬南芥根外植體經CIM(callus induction medium)誘導後, 與組蛋白修飾相關的N-乙醯轉移酶類基因以及大量編碼轉錄因子類基因表達顯著上調[81], 而擬南芥地上器官在外植體的愈傷組織誘導過程中, 編碼染色體重組因子、組蛋白去乙醯化酶、甲基轉移酶和乙醯轉移酶等表觀遺傳修飾相關基因也發生明顯改變[82].
近年來利用模式植物擬南芥的離體再生體系揭示了植物離體器官愈傷組織的細胞起源和分子特徵. 擬南芥的根和下胚軸在誘導愈傷組織的培養基上, 其木質部極的中柱鞘細胞首先發生幾輪垂周分裂產生小細胞, 接著再發生平周分裂, 之後不斷地進行細胞分裂形成愈傷組織[83]. 與此類似的是, 擬南芥地上器官包括葉片和花瓣外植體的愈傷組織也是起始於維管周圍特異表達中柱鞘標誌基因的細胞, 稱為類中柱鞘細胞. 如果用特異白喉毒素A鏈(diphtheria toxin chain A, DTA)去除木質部極中柱鞘細胞, 則外植體不能產生愈傷組織[84]. 因此, 離體培養中不同外植體愈傷組織似乎主要起始於組織內的中柱鞘或類中柱鞘細胞. 進一步以擬南芥根原基各細胞層標記分析來自根、子葉和花瓣為外植體愈傷組織的細胞屬性發現, 根原基分生組織的標誌基因WOX5, SCARECROW(SCR), SHORT ROOT(SHR)和PLETHORA 1(PLT1)在愈傷組織中高度表達[83,85], 說明愈傷組織細胞屬性類似根端分生組織的特徵. 三種外植體愈傷組織誘導前後的轉錄組分析也表明, 愈傷組織誘導後, 根分生組織相關基因的表達發生明顯上調; 與莖端分生組織或者胚胎相比, 愈傷組織的分子特性更類似於根分生組織[85]. 此外, 側根起始缺陷突變體alf4的根、子葉和花瓣外植體在CIM上不能形成愈傷組織[85], 進一步佐證了生長素誘導的愈傷組織是中柱鞘類細胞以類似側根發生的方式, 具有根分生組織特徵.
在離體愈傷組織誘導過程中, 生長素被認為對細胞命運的轉化起決定作用, 這也在很多物種的離體再生體系實踐中的得到了印證. 擬南芥生長素信號因子功能獲得突變體indole-3-acetic acid 14/solitary-root(iaa14/slr)表現出側根和愈傷組織形成的缺陷, 而位於IAA14和生長素信號因子AUXIN RESPONSE FACTOR 7(ARF7)和ARF19下遊的LBD類轉錄因子在愈傷組織形成過程中起到了關鍵的作用[86]. 在CIM誘導條件下, 受生長素誘導的LBD16, LBD17, LBD18和LBD29在中柱鞘類細胞中被迅速誘導, 超表達其中任何一個LBD轉錄因子則引起植株和外植體在無激素培養基上自主形成愈傷組織; 而LBD功能缺失則嚴重抑制外植體愈傷組織在CIM上的形成[86]. 擬南芥LBD轉錄因子可以與另一類轉錄因子BASIC REGION/LEUCINE ZIPPER MOTIF 59(bZIP59)形成轉錄複合體來調控生長素誘導的愈傷組織形成[87]. 對LBD29的直接靶基因分析也發現, 愈傷組織形成過程中涉及了甲基化、活性氧特別是脂類和細胞壁相關的代謝變化[88]. 與之相一致的是, LBD16-bZIP59複合體也直接調控了細胞壁組分代謝基因FAD-binding Berberine(FAD-BD)的表達[87], 而LBD18不僅調控了細胞周期中關鍵作用的轉錄因子E2 PROMOTER BINDING FACTOR a(E2Fa)的表達, 也直接調控激活細胞壁鬆弛因子基因的表達[89], 說明細胞壁的動態重塑過程也是愈傷組織形成的重要因素.
目前的研究顯示, 外植體在誘導愈傷組織培養基上形成愈傷組織過程中, 除了能夠促進中柱鞘類細胞增殖外, 其細胞命運轉變為根分生組織的特性對於獲得芽再生能力非常重要. 在此過程中, 生長素可以誘導PLT3, PLT5和PLT7的表達, 而三個轉錄因子又可激活根分生組織的特徵基因PLT1和PLT2以及芽再生特徵因子CUP-SHAPED COTYLEDON 1(CUC1)和CUC2的表達從而賦予愈傷組織再生芽的能力[90]. plt3 plt5 plt7突變體在CIM培養基上愈傷組織形成正常, 但是它們的愈傷組織不能再生芽, 而過表達PLT1和CUC1能夠恢復plt3 plt5 plt7突變體愈傷組織的芽再生能力[90]. 綜上, 這些發現表明, 獲得根分生組織特性包括PLT1, WOX5以及SCR等的激活可能是賦予愈傷組織芽再生能力的必要因素(圖4).
有意思的是, 通過篩選擬南芥iaa14/slr的抑制子發現, 超長鏈脂肪酸含量降低會增強植物的愈傷組織形成能力; 而外施超長鏈脂肪酸會抑制中柱鞘細胞的愈傷形成能力, 說明超長鏈脂肪酸或其衍生物很可能作為限制植物器官的愈傷組織形成的信號存在(圖4). 超長鏈脂肪酸作為信號分子調控愈傷組織形成並不依賴於生長素調控側根發生的IAA14信號通路, 而是通過抑制中柱鞘類細胞分生能力關鍵基因ALF4的表達實現的[91].
1957年, Skoog和Miller[7]發現, 將愈傷組織轉移到高細胞分裂素的生芽培養基(shoot-inducing medium, SIM)上是誘導芽再生的必需條件[15]. 通過遺傳學、活體細胞成像和分子生物學等手段, 擬南芥芽再生的分子框架圖以及細胞分裂素誘導莖端分生組織重新建立的「two-step」模型被相繼提出. WUSCHEL(WUS)是芽從頭再生的重要調控因子. WUS是第一個被發現的WOX基因, 它在SAM幹細胞龕的組織中心(organizer center, OC)表達, 對於維持SAM幹細胞活性至關重要[92,93]. 研究發現, wus突變體完全喪失芽再生能力, 表明WUS也是調控芽再生的關鍵因子[94]. 根據WUS的表達特徵, 將芽再生過程劃分為四個時期: 在芽再生起始階段, WUS非常特異地表達在單個細胞中, 之後經歷細胞增殖的過程, 隨後分化出莖端分生組織幹細胞. WUS的表達直接受到細胞分裂素信號途徑關鍵因子——B型ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATOR(ARR)轉錄因子的調控. B型ARR直接結合到WUS啟動子區域, 並激活WUS的表達[95,96]. B型ARR對WUS的激活分為兩步, 具有嚴格的時空性. 首先, 高細胞分裂素環境會導致WUS座位出現重編程. 隨著愈傷組織的細胞分裂, WUS座位的H3K27me3表觀抑制修飾逐漸丟失, 在2~3天後, WUS座位的染色質處於打開狀態, 可以被B型ARR激活. WUS重新激活的空間特異性與microRNA165/6(miR165/6)靶標的HOMEODOMAIN-LEUCINE ZIPPER III(HD-ZIP III)的轉錄因子密切相關. 與B型ARR的遍在表達不同, HD-ZIP III僅在愈傷組織的一部分細胞中表達. HD-ZIP III能夠特異性地與B型ARRs結合, 形成轉錄複合體激活WUS, 從而決定了WUS表達的空間特異性[95](圖5).
芽再生能力受到內源和外源因素的共同影響. 由於芽的再生能力伴隨植物年齡增長而遞減, 因此在組織培養過程中, 通常選取胚胎期和幼年期的組織作為外植體. 研究發現, 雖然幼年期和成年期葉片的細胞分裂素含量沒有差異, 但是提高細胞分裂素濃度可以恢復成年期植物葉片再生能力下降的缺陷. 進一步研究表明, 在擬南芥和菸草中, 年齡途徑關鍵調控因子miR156的含量與植物再生能力呈正相關: 過量表達miR156可以顯著提高葉片的莖尖再生率. 從分子機制上看, 隨著植物年齡的增長, miR156的表達逐漸降低, 導致其靶基因SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE(SPL)類轉錄因子含量的上升. SPL可以與細胞分裂素信號途徑的關鍵轉錄因子B-ARR結合, 導致B-ARR的轉錄激活活性受到抑制, 呈現細胞分裂素的不敏感性, 進而導致莖尖再生能力的下降. 這一研究成果表明, 年齡途徑可以通過調控細胞分裂素的信號輸出調控植物的再生能力, 提示年齡可能是植物細胞全能性的一個重要調控因素[97].
除了WUS座位的H3K27me3擦除外, LYSINE-SPECIFIC DEMETHYLASE 1-LIKE 3(LDL3)介導的組蛋白H3K4me2去乙醯化也是芽再生的一個先決條件. 缺失LDL3會導致芽再生能力的顯著下降[98]. 研究發現, 在CIM培養的後期, LDL3會擦除芽再生相關基因座位的H3K4me2表觀標記. 有趣的是, H3K4me2表觀標記的擦除雖然並不會立刻導致這些基因表達量的改變, 但是會讓這些基因處於一種準備(priming)狀態. 當愈傷組織轉移到SIM培養基上後, 這些基因便快速被誘導表達, 激活芽再生的發育程序.
5.4 體細胞胚胎發生
與通過愈傷組織-芽再生技術實現植物再生不同, 多種植物外植體可以通過離體培養誘導胚胎發生, 包括雄配子體和雌配子體的單倍體細胞誘導[99]和孢子體的營養體細胞誘導[100], 即體細胞胚胎發生(somatic embryogenesis). 體細胞胚胎發生是指植物體細胞在未經生殖細胞融合的情況下, 模擬有性的合子胚胎發生而發育形成一個新個體的形態發生過程, 它是誘導植物細胞實現全能性的一種形式. 除最早建立的胡蘿蔔體細胞胚的離體誘導系統外, 很多植物的小孢子可以改變分化命運, 並經胚胎發生途徑形成單倍體植株, 這一過程稱為花粉胚胎發生. 在這個過程中, 小孢子細胞需要首先受到營養飢餓、低溫或高溫等外界環境脅迫的誘導, 使細胞發育停滯, 細胞命運發生重編程啟動胚胎發育模式. 此時將小孢子細胞轉移到正常培養環境, 它會持續進行分裂, 並最終形成體細胞胚[101]. 20世紀90年代起, 擬南芥體細胞胚胎發生系統已經開始建立, 隨後逐步完善. 擬南芥葉片原生質體能夠誘導體細胞胚的產生, 但是誘導頻率很低, 並且體細胞胚的發育會終止在球形胚早期[102,103]. Sangwan等人[104]和Wu等人[105]報導了以未成熟合子胚作為外植體首先誘導胚性愈傷組織的產生, 進而誘導體細胞胚胎發生. 在這個系統中, 從合子胚誘導獲得的體細胞胚可以發育成為完整植株, 而合子胚外植體的發育時期對於誘導愈傷組織的形成和體細胞胚胎發生至關重要[105]. 2002年, Ikeda-Iwai等人[106]進一步完善了上述培養體系. 在新體系中, 合子胚外植體首先誘導產生初級體細胞胚, 然後在液體培養基中懸浮培養產生胚性細胞團, 進而誘導產生次級體細胞胚. 這種液體培養系統不僅提高了胚性細胞的增殖速率, 還增加了次級體細胞胚的數量. 離體培養誘導的體細胞胚胎發生被認為是植物細胞全能性的完全呈現. 因此, 研究體細胞胚胎發生的分子機理對於揭示細胞全能性表達機制具有十分重要的意義.
植物的體細胞經過重編程過程形成胚性愈傷組織, 再從愈傷組織的某些胚性細胞分化形成體細胞胚, 這個過程稱為體細胞胚的間接發生途徑. 現有的絕大多數體細胞胚胎發生的機理研究都是在間接發生系統中進行的. 與芽再生類似, 誘導體細胞胚產生的胚性愈傷組織從中柱鞘細胞和非中柱鞘類細胞發育而來[107,108]. 胚性愈傷組織形成後, 在愈傷組織的表面或內部首先產生由分裂旺盛、排列緊密的小細胞組成的胚性細胞團, 單個或多個胚性細胞被選擇從胚性細胞團中發育成為體細胞胚[109,110]. 通常在用生長素類似物特別是2,4-D處理後能觀察到愈傷組織和胚性細胞團(圖6)[111]. 雖然生長素促進愈傷組織和胚性細胞團的起始和增殖, 但是體細胞胚的間接誘導通常需要將外界環境中的生長素去除, 才能啟動體細胞胚胎發生和胚胎的形態建成[112].
在體細胞胚的直接發生途徑中, 其特徵是沒有明顯的愈傷組織誘導階段(圖1). 單個或多個胚性細胞被選擇後直接發育成為形態學上可識別的胚[113]. 目前很多研究認為, 外植體直接或間接的體細胞胚發生的能力可能取決於外植體的年齡: 外植體離合子胚階段越遠, 就需要越多的細胞重編程過程形成胚性愈傷組織, 進而誘導體細胞胚. 但也有一些外植體誘導體細胞胚發生時, 無論組織的發育程度如何, 它們都可以通過直接或間接途徑產生體細胞胚[108,114,115]. 例如山茶子葉基部的表皮細胞能夠直接誘導產生體細胞胚. 而利用槐樹子葉進行離體培養時, 在切口處產生愈傷組織誘導體細胞胚胎發生的同時, 也可以由子葉細胞直接誘導產生體細胞胚. 因此, 在確定胚胎發生是直接還是間接時, 似乎外植體細胞或組織的發育背景與培養環境的結合比其與合子胚時期的發育距離更為重要.
由於一直缺乏直接證據, 不論是通過直接發生途徑還是間接發生途徑, 體細胞胚發生究竟起源於單細胞還是多細胞成為亟待解決的關鍵科學問題之一. 研究表明, 間接的體細胞胚胎發生需要莖端分生組織的重新誘導形成[111]. 擬南芥莖端分生組織幹細胞關鍵基因WUS最先在胚性愈傷組織的一小團細胞中特異激活表達, 此時並未觀察到形態可見的體細胞胚, 而另一個幹細胞特徵基因CLV3隨後在球形體細胞胚形成階段被迅速誘導表達, 標誌著愈傷組織中幹細胞的出現和莖端分生組織的逐步形成. 影響擬南芥根端分生組織形成的關鍵調控因子WOX5和PLT2的表達模式與體細胞胚發生過程中胚根分生組織的建立有關[115]. WOX5與WUS在體細胞胚發生過程中的早期就被誘導表達, 並且二者誘導表達時在胚性愈傷組織的表達區域基本重疊, 說明愈傷組織誘導體細胞胚的過程在該體系中可能是由多細胞起始的(圖5). 而外植體直接誘導體細胞胚胎發生是由單個細胞還是多個細胞直接發育成體細胞胚, 目前尚不清楚.
近年來, 關於體細胞胚胎發生的分子機理已經有了較深入的研究, 一些參與體細胞胚發生的重要的轉錄因子被鑑定出來, 它們可以歸為以下4類. 第一類, 擬南芥合子胚發育過程中的許多關鍵基因在誘導體細胞胚胎發生過程中起著十分重要的作用(圖6). LEAFY COTYLEDON(LEC)蛋白LEC1和LEC2是最初被發現的在幼苗中異位表達能誘導體細胞胚產生的轉錄因子[116,117]. LEC1和LEC2是擬南芥合子胚特異表達的轉錄因子, 它們突變體的胚子葉上長出具有真葉特徵的表皮毛, 並且種子中不積累貯藏蛋白[116~119]. LEC1和LEC2的異位表達能夠在擬南芥幼苗的子葉和真葉上誘導體細胞胚的形成[116,117]. 在合子胚發生過程中, ABA-INSENSITIVE 3(ABI3)和FUSCA3(FUS3)基因的表達起始於較早的時期, 並且一直持續到胚胎發生後期. 其超表達不能誘導體細胞胚的產生, 但確實賦予真葉具有子葉的特徵, 如無表皮毛等[120,121]. 第二類可以誘導體細胞胚胎發生的轉錄因子是RWP-RK DOMAIN-CONTAINING 4(RKD4)/GROUNDED(GRD)[122]. RKD4在早期合子胚的胚本體和成熟胚胎的胚柄中表達. RKD4的突變導致胚柄變短和胚胎發育停滯, 而幼苗中RKD4的過量表達會使根細胞過度增殖, 並從中再生出體細胞胚[122]. 第三類轉錄因子稱為BABY BOOM(BBM), 它是AP2/ERF轉錄因子中AINTEGUMENTA-LIKE(AIL)分支的成員之一[123], 它的異位表達能夠在沒有外源激素的情況下使擬南芥幼苗的真葉和子葉上均能誘導體細胞胚的產生[123]. 在水稻中, BBM的過量表達能夠誘導卵細胞在未受精的情況下進行細胞分裂並產生胚, 實現孤雌生殖[124]. 第四類轉錄因子屬於AP2/ERF轉錄因子家族. WIND1及其同源基因能夠被損傷誘導表達, 並且在植物組織受損後能刺激愈傷組織細胞的增殖[53]. WIND1異位表達促進芽、下胚軸和根等外植體產生愈傷組織[53], 並在愈傷組織上誘導芽、根或體細胞胚的產生[125]. 此外, 在擬南芥中過量表達WUS能夠誘導芽和體細胞胚的發生[94,126,127]. 上述研究表明, 在植物發育過程中, 多種不同類型的轉錄因子過表達都能誘導體細胞胚的產生. 其中, 一些轉錄因子在早期胚胎發育或後期維持胚成熟特徵方面具有重要作用.
植物激素在體細胞胚的誘導過程中起著重要作用. 去除外源生長素誘導體細胞胚胎發生後, 首先在胚性愈傷組織的表面出現多個生長素響應的區域, 進而發現體細胞胚即起始於這些生長素響應信號集中的愈傷組織區域. 因此, 體細胞胚的誘導與生長素響應信號的極性分布相關. 進一步分析生長素極性運輸蛋白PINFORMED(PIN)的分布模式, 結果顯示, 在將形成體細胞胚的愈傷組織細胞中存在生長素的極性運輸. 而生長素極性運輸抑制劑NPA(N-1-naphthylphtha-lamic acid)的施加則抑制了體細胞胚的產生[111]. 胚性愈傷組織中生長素響應梯度的建立是誘導莖端分生組織幹細胞形成的關鍵信號. 因此, 在體細胞胚的誘導過程中, 生長素極性運輸決定了愈傷組織中生長素的響應模式, 從而誘導並維持莖端分生組織幹細胞的產生. 除生長素外, 其他激素也在體細胞胚的誘導過程中起重要作用. 通過分析細胞分裂素在體細胞胚起始過程中的響應模式發現, 細胞分裂素響應信號出現的區域能夠誘導WOX5的表達從而導致體細胞胚的形成. 過表達擬南芥細胞分裂素信號轉導途徑的反饋抑制子ARR7與ARR15能夠影響根端分生組織及體細胞胚的形成. 這些結果為人們認識生長素與細胞分裂素調控體細胞胚胎發生過程中基-頂軸的極性建立及頂端分生組織的形成提供了重要的信息[115]. 研究還表明, 體細胞胚的誘導引起乙烯合成和信號轉導的下調, 這對於YUC基因介導的生長素區域性合成是必需的[128]. 過量乙烯通過抑制YUC基因介導的生長素區域性合成, 幹擾生長素響應信號的極性分布, 最終抑制體細胞胚胎發生. 體細胞胚胎發生伴隨著內源ABA(abscisic acid)水平的不斷下降. 然而, 阻斷內源ABA的合成途徑, 也影響生長素極性分布模式的建立, 進而抑制體細胞胚胎發生過程. ABA通過影響愈傷組織中生長素的合成、極性運輸和極性分布從而調控體細胞胚的發生[129].
6 學科發展的方向與展望
隨著植物再生和細胞全能性分子機理的深入研究, 細胞生物學和分子遺傳學的廣泛應用, 傳統教科書中關於組織培養和植物再生的一些經典理論受到了挑戰: 是不是所有的植物細胞都具有再生能力(目前可以說肯定不是, 例如, 因為植物在生長發育過程中, 隨細胞分裂, 會產生大量的體細胞變異, 甚至染色體的組型有大的改變, 如出現多倍性、非整倍體等, 這些都會影響全能性表達)? 再生能力的實現是否都要經歷細胞脫分化過程? 愈傷組織為什麼是非均一的細胞團? 如何進一步理解和更新愈傷組織的概念? 植物和動物在再生過程中採取了很多類似的細胞和分子策略, 這種可能是趨同進化的結果是否可以互相借鑑? 對這些問題的回答將幫助人們進一步認識再生的本質.
提高作物的再生效率是今後植物組織培養和細胞工程的一個重要發展方向. 不管是動物還是植物, 再生能力與個體年齡密切相關. 隨著個體年齡的增加, 再生能力逐漸降低. 體細胞胚的發生一般選取幼嫩的胚作為外植體, 而器官從頭再生一般選取幼苗期的組織. 那麼在種子萌發後, 體細胞胚的發生能力為什麼會大大下降呢? 為什麼大多數植物的成年期外植體不能在激素的作用下形成具有分化潛能的愈傷組織呢? 此外, 在長期繼代培養中, 愈傷組織的再生能力也會逐漸下降, 其背後的分子機理至今也未闡明. 這些問題的解答, 將有助於人們更好地理解年齡如何調控植物細胞命運的轉變和再生潛能, 並在此基礎上建立一套高效的再生系統.
目前對於器官從頭再生和體細胞胚的誘導發生的細胞學及分子水平的研究都比較少, 根、芽和體細胞胚是起源於外植體的單細胞還是多細胞? 這些根、芽和體細胞胚來源於外植體的哪些類型的細胞? 這些細胞是如何在傷口、愈傷組織和胚性細胞團中被選擇而進行重編程, 從而分化為根尖、莖尖和體細胞胚? 在細胞命運重編程的過程中, 哪些調控因子被誘導表達並起到關鍵的調控作用, 是一個什麼樣的網絡? 這些問題尚不清楚. 目前單細胞測序及基因編輯等技術已經越來越廣泛地應用於植物細胞的譜系追蹤及細胞分化命運的研究中, 今後需要利用這些先進技術並結合傳統研究方法, 分析體細胞分化為根端/莖端分生組織和胚胎細胞的基因表達譜, 鑑定決定體細胞全能性表達的關鍵因子, 以解析植物細胞全能性和多能性誘導表達的分子遺傳網絡.
植物細胞全能性和多能性的誘導發生機理一直是植物科學研究領域極為重要的科學問題. 具有細胞全能性和多能性的細胞究竟具有怎樣的特徵, 二者有何區別? 它們在染色質水平、基因表達水平究竟有著怎樣的特殊性? 細胞表達全能性的開關因子是什麼, 它是如何啟動細胞重編程進入胚胎發育程序? 回答植物如何從一個單細胞通過細胞分裂和分化產生一個個體是植物發育生物學領域的核心問題. 該問題的解答, 將為人們建立一套普適的植物再生方法提供理論基礎. 可以預見這些新技術的發展將和基因組編輯技術相結合將作物的分子育種技術提升到一個新的水平, 在短時間內培育出更多高產、多抗、環境友好的未來作物, 保證世界農業的可持續發展.
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