制樣原理：使試樣從不規則的固體顆粒狀成為較小的均勻統一的粉末，有利於反應的充分進行，增加結果的準確性。
☞事例1：以豆粕為例：豆粕因為其生物結構特性：表皮較脆軟易粉碎，但蛋白含量低；豆粕芯質地較硬難粉碎，蛋白含量高。故實際操作中會出現粉碎不均勻的現象。
圖一是本實驗用於粉碎樣品的刀片型粉碎機，對豆粕表皮具有很好的粉碎性，對豆粕芯會出現不易完全粉碎的情況。
圖二所示：上圖是未過篩的試樣；左下圖試樣40目篩上物；右下圖試樣40目篩下物。我們可以清晰的看出：上圖粉碎之後的豆粕試樣仍然很不均勻，粗細不一；左下圖篩上物量多，大多為豆粕芯未通過篩；右下圖過篩後的豆粕均勻細膩。
在實際情況中用粉碎機粉碎後，我們選擇不過篩，而是把試樣裝入樣品袋中，搖勻，平放，用小號糧食取樣器以對角線直插入樣品袋取出樣品，儘可能保證取樣的均勻性。因為我們之前對過篩和不過篩的樣品進行實驗（見表1），結果顯示過篩的試樣蛋白含量是偏小的，因為通過篩的大多是蛋白含量較低的豆粕表皮，留在篩上的是蛋白含量較高的豆粕芯，因而影響結果。
表1 粉碎程度對粗蛋白含量測定結果的影響（%）
樣品粗蛋白實際含量不過篩均勻取樣含量完全粉碎後過篩均勻取樣含量豆粕45.0645.0444.36因飼料對粗蛋白含量的精確度要求較高，從上表結果中我們可以看出，粉碎程度對蛋白含量測定結果的影響之大。
☞事例2：以魚粉為例：先將粉狀試樣充分搖勻，再用四分法分樣至200g。進粉碎機充分粉碎，裝入試樣袋。下圖中左圖為未粉碎的魚粉試樣；右圖為粉碎後的魚粉試樣。可看出粉碎後的魚粉顆粒均勻規整
一般試樣：原則上是採用四分法採樣，四分法採樣是針對量多的樣品。但是實際檢測中，我們接到委託單的樣品約在200g，所以採取全粉碎不過篩均勻取樣的方式
2、樣品稱量
用分析天平準確稱取0.2-0.5g（精確到0.0001g），以保證式樣的含氮量在30-40mg。使滴定時鹽酸滴定液的消耗體積保持在10-20ml之間，會較大程度上避免滴定液體積過小帶來的誤差，提高結果準確性。根據實驗總結：濃縮飼料（粗蛋白含量≥40%），稱量範圍可在0.2-0.3g之間；配合飼料（粗蛋白含量≤20%），稱量範圍可在0.4-0.5g之間。
消化原理：試樣同催化劑（硫酸銅+無水硫酸鈉）（催化劑的作用：加速、完全有機物質的分解，縮短消化時間，）和濃硫酸反應，使蛋白質遭到破壞，使試樣中的蛋白質氮及其他有機氮轉化為氨態氮，然後與硫酸結合生產成硫酸銨。便於氮含量的測定。
試樣+ H2SO4SO2+H2O+CO2
2NH3 + H2SO4﹦(NH4)2SO4
1、消化裝置
消化器（圖四）因其孔槽受熱程度存在差異，所以會和預設溫度存在偏差，影響消化結果。故定期對消化裝置進行維護和檢查，確保裝置的加熱均勻。
圖四
☞事例3：對消化器不同孔的溫度進行考察，結果如表2
表2 消化器各孔間的溫度對比（℃）
孔12345溫度420405419419419蛋白含量（%）42.1340.0542.0742.0442.09可以看出，不同的消化孔存在明顯溫度差異，如孔2：測試蛋白含量偏差嚴重，消化溫度偏低，使消化不完全影響含量測定的結果。分析孔2溫度差異的原因：消化器長期使用，使得空內有汙垢、結塊，影響傳熱所致。故須定期維護。
2、消化時間及溫度
根據標準規定：消化時間要達到4h，時間不充分會造成消化不完全，消化時間過長會造成蛋白的損失已及浪費能源。
要使消化溫度達到420℃，使消化完全，溫度低會造成消化不完全，溫度過高會使氮氣逸出影響結果。
表3 不同消化時間對魚粉、豆粕、DDGS的檢測結果的影響
消化時間/h魚粉（%）豆粕（%）DDGS（%）350℃420℃350℃420℃350℃420℃240.1853.3230.8240.4715.4620.14357.8860.0238.6641.5822.1824.50462.8664.2441.4443.1224.3027.39標準值64.2543.1427.33從表3可知，最佳消化時間為4h，最佳消化溫度為420℃。消化的時間和溫度都對檢測結果的影響很大。進行實驗時要嚴格把控。
3、催化劑
添加催化劑是為了提高硫酸沸點、加快有機物分解。但是催化劑添加量也需謹慎：用量過少使有機物分解速度緩慢，延長消化時間；催化劑用量過多，易造成氮的損失。國標規定：6.4g催化劑對12ml硫酸可滿足大部分樣品需要。如若增加酸的量，可適當對催化劑的量進行調整，以及蒸餾時鹼的用量也需調整。
4、硫酸含量
方法中使用硫酸來破壞蛋白質，所以硫酸的質量嚴重影響後續實驗的結果。需要格外注意的是不能使用含氮的硫酸，對硫酸成分要事先驗收。
☞事例4：本實驗室有一次換用其他品牌的硫酸，驗收時發現其中含有氮，所以不能用於蛋白的檢測。將其與不含氮的硫酸同條件進行實驗，看其對結果的影響多大。含氮硫酸測出的蛋白含量為45%，與客戶提供的參考值40%相差5%；使用驗收不含氮的硫酸測量後的結果為40.06%，與顧客提供值無差。由此可見，硫酸質量對結果的影響，實驗前務必做好驗收工作
圖五為消化完全後的試樣，呈澄清的藍綠色。
蒸餾原理：在硫酸銨中加入過量強鹼（氫氧化鈉溶液）進行蒸餾，加熱，使NH4+轉變成NH3逸出，同時用硼酸吸收，硼酸接受氨後，形成四硼酸銨。
2NH4+ + OH-﹦NH3 + H2O
NH3 +H3BO3﹦NH4+ + H2BO3-
每次蒸餾前都要先對凱氏定氮儀進行檢查、清洗，方可使用。
1、蒸餾檢驗：儀器含氮量測定能力
精確稱取0.2g硫酸銨代替試樣，對其進行蒸餾、滴定、計算。得到的含氮量應為21.19±0.2%。若結果低於該值，可能是由於（1）蒸餾不完全；（2）定氮儀漏氣；（3）加入的鹼未過量等情況造成，會導致檢測結果偏低。若結果高於該值，則可能是（1）凱氏定氮儀受到了汙染；（2）消化、滴定等步驟出現錯誤，檢測結果會偏高。以上兩種情況都不能繼續實驗，要查明原因。
2、蒸餾時間
把握好蒸餾時間，適宜的時間是5min。低於5min，結果蛋白質含量偏低；高於5min對結果沒有明顯改善，還會造成時間和資源的浪費。
表4 蒸餾時間對粗蛋白含量測定結果的影響（%）
蒸餾時間/min34567粗蛋白含量44.8545.0845.1045.1045.12嚴格把控蒸餾時間，保證結果準確性。
3、加入鹼的濃度
選用40%的NaOH水溶液 50ml，分5次加入，使其充分與試樣溶液反應，從藍綠色變成黑色。只有與NaOH溶液充分反應，才能使氨氣充分逸出。
圖六左圖為蒸餾中的凱氏定氮儀；右圖為蒸餾後準備滴定的試樣。
滴定原理：用標準鹽酸滴定，直到硼酸溶液恢復原來的氫離子濃度。滴定消耗的標準鹽酸摩爾數即為NH3的摩爾數，通過計算即可得出總氮量。在滴定過程中，滴定終點採用甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑顏色變化來判斷。測定出的含氮量是樣品的總氮量，包括有機氮和無機氮。
H2BO3- + H+﹦ H3BO3
1、滴定時的溫度
滴定溫度是易忽視的因素，室內是否處於恆溫狀態，會造成滴定液的體積變化（易熱脹冷縮），溫度驟升，使鹽酸滴定液膨脹，導致結果偏大；反之，溫度驟降，結果偏小。所以在實驗開始前要確保實驗室的溫度狀況，保證25℃恆溫。否則嚴重影響計算結果。
2、指示劑
是否使用有效的指示劑：甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑應保存在陰涼處，保質期是2個月，指示劑的加入量為1-2滴。
3、滴定液的影響
鹽酸滴定液直接影響計算結果，要確保鹽酸標準溶液是否準確（標準中為0.02M或0.1M）。我們嚴格按照GB/T 601-2002 化學試劑 標準滴定溶液的指標中的相應規定，採取兩人四平行對滴定液進行標定。
表5 不同樣品、不同濃度鹽酸滴定的平均消耗量（ml）
樣品鹽酸平均消耗量（M）0.100.05進口魚粉6.7513.65豆粕4.859.75玉米秸稈飼料0.851.55不同濃度的鹽酸對同一個樣品的影響巨大，較好的鹽酸滴定液消耗量在10-20ml之間。
4、酸式滴定管
定期對滴定管進行校準，控制偏差。
5、空白樣、質控樣
是否有空白樣和質控樣，才能保證結果的準確度和可信度。空白樣品消耗鹽酸的量以0.05-0.15ml為宜，檢測時如果發現空白值過高，應及時解決。一般是由試劑級別不夠，實驗用水不純或玻璃器皿不淨等所致。質控樣是已做出並得到肯定的結果，質控樣能夠對整個實驗過程起到監控作用。
6、終點判斷
對於終點的判斷（圖八左上），要與空白樣（圖八左下）的顏色保持一致，這樣才能保證實驗的一致性、準確性。可以在滴定架的下方和垂直面均放置白色比色板方便觀察。讀數時一定要水平直視刻度線（圖八右上），不能偏高或偏低誤讀。
以上，是凱氏定氮法檢測飼料中粗蛋白過程中需要注意的問題和對應的解決方案，做到以上這些，能提高實驗的準確度，減小誤差。
本文作者 ：技術部 吉楊萱