禽流感難以確診怎麼辦?你需要了解禽流感診斷技術

禽流感病毒

禽流感病毒（Avian Influenza Virus）屬於正粘病毒科流感病毒屬，分為A、B、C三個型，其中A型流感病毒感染的範圍最廣，危害最大，它可以感染人、豬、馬、哺乳動物、禽類等，是人和畜禽呼吸道疾病的重要病原。由禽流感病毒感染的家禽，其臨診症狀及剖檢的病理變化通常會因感染病毒毒株及特點有所差異，臨診上難以確診，因此，為了有效的對禽流感病毒進行監測，及時發現流行的毒株進而控制該病毒的傳播，我國動物流感研究中心建立了不同的禽流感病毒診斷技術，以滿足我國禽流感流行病學監測及現地診斷與防制的迫切需要。

禽流感病毒分子結構圖

一

禽流感樣本的採集

對於來自活禽的樣本主要採集洩殖腔和喉氣管拭子，研究表明，洩殖腔和喉氣管拭子樣品對於檢測禽流感病毒結果準確。將棉拭子插入洩殖腔1.5cm～2.0cm處，旋轉後沾上糞便獲得洩殖腔拭子樣品；將棉拭子插入口腔至咽的後部直達喉氣管，輕輕擦拭並慢慢旋轉沾上氣管分泌物從而獲得喉氣管拭子樣品。對於病死禽類主要採集其組織樣品，每隻禽分別採集腸管及腸內容物各1份；肺和氣管樣品各1份；肝、脾、腎、腦等各1份，做好標記。採集的病原檢測樣品應保存於含有抗生素的PBS緩衝液中，加入抗生素的主要目的是用於消除任何可能干擾後續診斷的細菌。此外，從採集樣品開始，現場樣本應始終嚴格保持在低溫條件下，切忌頻繁的反覆凍融，如果採集到的樣品不能在短期內進行檢測，建議將所有樣品應保存在-80℃冰箱內。

二

禽流感病毒的分離培養

流感病毒於1933年被科研人員將樣品接種到10～12胚齡的雞胚羊膜腔中，首次成功分離，證實雞胚中的羊膜腔和尿囊腔的細胞非常適合流感病毒的增殖，這種使用SPF雞胚分離禽流感病毒的方法，不僅是診斷AIV的金標準技術，而且是可以經過雞胚接種產生高滴度的禽流感病毒的方法。樣品接種SPF雞胚後，如果沒有血凝價，可將收集的尿囊液連續盲傳三代後重新檢測血凝價後，若仍無血凝價，則可以確定該樣品不含禽流感病毒。如果有疑似HPAI的樣品，則必須在生物安全三級實驗室內進行操作。

19世紀40年代有學者使用細胞進行了流感病毒的分離培養，為在雞胚中不能很好生長的人或豬流感病毒提供了可行的分離培養方法，該方法可培養並擴增病毒，所以這種方法比直接檢測更靈敏，但該方法需要將樣品快速地運輸到實驗室，因為延遲可能導致病毒失活，從而不能做到從任何感染物上分離到病毒。

三

禽流感病毒的分子生物學檢測技術

目前禽流感的分子生物學檢測技術主要有RT-PCR技術、螢光定量RT-PCR技術、核酸依賴的擴增技術(NASBA)、基因晶片技術以及LAMP技術等。

1.RT-PCR技術

RT-PCR技術從基因水平檢測禽流感病毒，具備高度敏感性和特異性。目前應用RT-PCR方法對流感病毒進行診斷的報導很多，根據細節不同分出多種RT-PCR技術，常見的有常規RT-PCR、巢式RT-PCR (nested RT-PCR)、多元PCR (multiplex PCR )等。現在仍以常規RT-PCR 應用較為廣泛，此方法可以利用基因擴增的方法直接檢出病毒的基因，較病毒分離快。

2.螢光定量RT-PCR檢測技術

通過螢光染料或螢光標記的特異性的探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程，結合相應的軟體可以對結果進行分析，計算待測樣品的初始模板量。是近年來應用較多的分子生物學檢測技術，該方法靈敏、快速，可對禽流感病毒的亞型進行區分，目前已經在省級以上動物疫病診斷機構廣泛使用。

3.依賴核酸序列的擴增技術(NASBA)

NASBA技術是一項以RNA為模板的快速等溫擴增技術，這項技術特別適用於RNA分子的檢測。這個檢測方法靈敏度高、特異性強、易於操作，而且在檢測過程中與系統發育學或臨床相關的病毒無交叉反應能力，為確定疫情和採取防範措施爭取了寶貴時間。

4.基因晶片技術

由於流感病毒擁有眾多的型和亞型，無論是現存的哪一種診斷方法都無法同時對所有的流感病毒進行精確的分型。基因晶片技術可以對成千上萬個基因進行檢測，它的出現為同時對流感病毒進行檢測和分型提供了可能的途徑。禽流感基因晶片技術是一種比較系統、完善的檢測技術，該方法的建立不僅有助於禽流感疫情各種亞型的有效監控，而且可以在第一時間內準確的發現新變異或基因重排的新亞型病毒，為應對新疫情暴發提供可靠的技術儲備。

5.LAMP技術

是分子檢測技術的又一突破，該方法通過兩對引物，利用Bst DNA聚合酶的鏈置換活性提供反應的動力，在恆溫條件下完成對核酸的擴增反應。該技術於恆溫條件下幾十分鐘內即可完成，無需昂貴的儀器設備，結果可肉眼直接觀察，具有簡便、快速、靈敏度高、特異性好等特點，非常適用於基層實驗室及大型養殖場的檢測。近年來，已有一些成功應用該技術對病原體進行檢測的文獻報導。

四

禽流感血清學檢測技術

在診斷禽類AIV過程中，血清學診斷方法不僅在監測種群的疫病上發揮著重要的作用，同時也為禽流感病毒感染的診斷提供了一個精確的方法。常用的AIV血清學檢測方法包括:血凝和血凝抑制試驗、神經氨酸酶抑制試驗、病毒中和試驗、酶聯免疫吸附試驗、瓊脂凝膠擴散試驗、間接免疫螢光試驗等。

（1）血凝和血凝抑制試驗(HA/HI)：其原理是依據流感病毒表面的HA蛋白可與含有唾液酸的糖蛋白結合，它們之間的結合比較緊密，不經特殊處理，難以分開，這種凝集是不可逆轉的。但該凝集可被相應的特異性抗體所抑制，因此血凝試驗通常用來進行禽流感病毒的初步檢測，檢測時間應控制在30min以內，否則易出現假陽性結果。一旦血凝試驗呈陽性結果，需要進一步考慮用特異性血清做血凝抑制試驗，與新城疫等有血凝活性的病原進行鑑別。

（2）神經氨酸酶抑制試驗（NI）：是鑑定AIV NA亞型的主要手段，其不會受到血清中非特異性因素的幹擾，有較高準確度，但需要注意，某些NA亞型之間可能會出現交叉反應，HA的抗體也可能對NA產生影響。

（3）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）：該方法是以抗原或抗體固相化以及酶標記技術為基礎的，抗原或抗體能在固相載體表面結合且保持原有的免疫學特性，經酶標記後的抗原或抗體複合物既保留了免疫學特性，又具備酶的活性。抗體結合顯色後利用酶標儀讀取結果，進行判定。ELISA檢測方法多種多樣，常見的有間接ELISA、競爭ELISA、DOT-ELISA等，該檢測技術具有較好的敏感性和特異性，既可以檢測抗原又可以檢測抗體，是一種快速的臨診診斷方法。

（4）病毒中和試驗（NT）：該方法是較為經典的血清學檢測手段，特異性、敏感性都比較好，同時可以測量動物體內中和抗體含量，但由於操作較繁瑣、耗時，當涉及到具有感染性病毒時需要在生物安全級別較高的實驗室操作，這使得該方法幾乎不應用於臨診快速診斷。

（5）瓊脂凝膠擴散試驗（AGP）：根據免疫沉澱原理，抗原和抗體可以通過懸浮的間質擴散到反應區域，當抗原抗體發生反應時，就會在瓊脂糖介質上產生一條白色沉澱線。該方法操作簡便、特異性較高，但是敏感性較低，對抗原抗體要求高，病毒必須經過裂解，故其已經很少使用。

（6）間接免疫螢光試驗（IFA）：該方法使用標記有螢光素的抗原或抗體進行反應來對流感病毒進行鑑定，具有簡便易操作、敏感、低費用等特點。