GABAA受體的冷凍電鏡結構（左）揭示了組胺分子是如何結合在蛋白口袋裡面的（右）（圖源：Sjors Scheres）
GABA受體是許多藥物的作用靶點，這是迄今為止最清晰的GABA受體結構。2014年，人們解析了GABA受體的首個晶體結構，但是解析度不高。在這個新的冷凍電鏡結構裡，許多單個的原子都清晰可見。這個高解析度冷凍電鏡結構不僅清晰地揭示了GABA受體的樣子，而且展示了該受體的配體——組胺分子是如何結合於受體口袋的。可以看到，蛋白的氫原子是如何與組胺的氮原子形成氫鍵作用的。水分子佔據了口袋裡面剩餘的空間，像泡沫包裝一樣緊緊地包裹著組胺分子。這是迄今為止最清晰的受體-配體複合物冷凍電鏡結構之一，解析度達到1.7 Å，接近於單個氫原子的尺寸（1 Å）。冷凍電鏡的使用已經有很長時間，但在過去的十年，這項技術一躍成為了分析大分子結構的有力工具。三位冷凍電鏡研究先驅——洛桑大學的Jacques Dubochet、哥倫比亞大學的Joachim Frank和MRC分子生物學實驗室的Richard Henderson也因此分享了2017年的諾貝爾化學獎。今年5月報導的這個GABA受體結構第一次生動地說明，冷凍電鏡這項技術能夠為我們提供足夠多的細節信息。這項工作還用冷凍電鏡解析了apoferritin蛋白的結構，解析度達到1.2 Å，打破了已有的冷凍電鏡解析度記錄。最終獲得的蛋白質結構中，每個氫原子都清晰可見，這也是冷凍電鏡第一次真正獲得了原子級別解析度的蛋白質結構。就在論文發布在bioRxiv預印本伺服器的同一天，另一組研究者也在伺服器在線發表了他們解析的解析度1.25Å的apoferritin冷凍電鏡結構。冷凍電鏡可以使科學家們清晰地觀察到，小分子是如何結合在蛋白質的活性口袋中的。不僅僅是結合了組胺的GABA受體，這項技術已經開始輔助藥物的設計和開發工作，包括潛在的治療COVID-19的藥物。然而，冷凍電鏡技術還是面臨著諸多挑戰和困難。樣品的製備是該技術的一大瓶頸。想要獲得蛋白質的三維結構，實驗者要花很長的時間來收集足夠多的數據。冷凍電鏡一直都價格不菲：幾乎所有高質量的蛋白質結構都是用Titan Krios冷凍電鏡解析的。這臺高達4米的「巨獸」價格超過六百萬美金，每天的運營成本就超過幾大千美金。因此，科學家們一邊在慶祝新的解析度記錄的誕生，一邊在想方設法讓冷凍電鏡變得更快、操作更簡便、價格更親民，希望它能夠成為「飛入尋常百姓家」的分析工具。X射線晶體衍射依然是解析蛋白質結構的主要手段。只要能夠獲得高質量的蛋白晶體，X射線晶體衍射獲得的蛋白質結構解析度要高於冷凍電鏡。然而，一些蛋白質很難結晶，還有一些蛋白質（比如GABA受體）的柔性太大，很難用X射線晶體衍射的方法來拍攝它們清晰的圖像。這時候，冷凍電鏡就提供了解決這些問題的手段。科學家們不需要獲得蛋白質晶體，只需要用液態乙烷把樣品快速冷凍。然後，冷凍電鏡會向樣品發射電子束，高速運動的電子撞擊到蛋白質的原子後分散開，再被接收裝置檢測到。經過多次的抓拍，從每一個角度捕捉圖案，產生數千甚至數十萬張照片。分析軟體會對生成的上TB大小的數據進行處理，重構出蛋白質的三維模型。冷凍電鏡相對於X射線晶體衍射還有其他的優點。研究人員經常用其他的試劑來對蛋白質進行修飾，以幫助結晶，以便進行X射線晶體衍射。冷凍電鏡可以在更接近於自然的狀態下觀察蛋白質。而且，這項技術需要的蛋白質用量更少。由於許多蛋白質是通過改變構象來完成生物學功能的，所以冷凍電鏡可以瞬間凍結不同構象的蛋白質，揭示其生物學功能的結構細節——這是靜態的X射線晶體衍射所不能做到的。在過去的15年裡，提交到Protein Data Bank的冷凍電鏡結構解析度穩步提高。研究人員認為，2014年解析度的激增可能是由於低質量蛋白質結構的突然激增，因為越來越多的科學家湧入了該領域。數據來自於EMBL European Bioinformatics Institute
冷凍電鏡技術仍然在進行著各種改進，包括電子探測器和數據分析軟體，這些突破使得該技術的進步突飛猛進。為了獲得破解析度紀錄的蛋白結構，MRC分子生物學實驗室的Radu Aricescu和Sjors Scheres與冷凍電鏡製造商Thermo Fisher Scientific合作，建造了一臺新的儀器，可以從探測到的電子信息中獲取儘可能多的數據。冷凍電鏡的廣泛使用是大勢所趨。自2010年以來，冷凍電鏡結構的平均解析度已從15Å提高到了6Å，而且3到4Å範圍內的蛋白質結構越來越常見。「冷凍電鏡變得越來越複雜，解析度也越來越好」總部位於英國劍橋的藥物公司Astex Pharmaceuticals表示。更好的樣品製備技術也對冷凍電鏡的發展有所幫助。研究人員對蛋白質樣品進行快速降溫時，部分分子會受到損壞或形成奇怪的構象。這種分子在樣品中所佔的比例越大，就需要越長的時間來收集有用的數據。五年前，紐約結構生物學中心的Bridget Carragher開發了一種自動樣品製備的噴霧工藝，可更快地製備樣品，減少對蛋白質的損傷。去年，該系統由英國SPT Labtech公司推向市場。在MRC分子生物學實驗室，Christopher Russo正在使用石墨烯來幫助保護樣品。他的團隊製備了帶有石墨烯層的金網格，並用胺，硫醇和羧酸等官能團進行了修飾。它們可以與蛋白質結合，防止它們在樣品製備過程中發生移動，並在收集冷凍電鏡圖像時保持穩定。MRC分子生物學實驗室的Sjors Scheres說，對電子探測器等零件的進一步改進，可能會在未來幾年讓冷凍電鏡解析到解析度為1 Å的蛋白結構，但進一步解析度的推進可能會適得其反。Christopher Russo說，化學反應過程的解析度為1Å，而要觀察生物學反應，3 Å的解析度就足夠了。儘管高解析度冷凍電鏡圖像會令人嘆為觀止，但我們要做的是用這些詳細的結構模型來了解蛋白質的功能，並開發與之相互作用的藥物。在3 Å附近，蛋白質的一級和二級結構都清晰可見，足以回答結構生物學中的許多問題。例如，輝瑞公司在用冷凍電鏡開發呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）的疫苗。RSV是嬰幼兒嚴重呼吸道感染的最常見病原體，每年造成12萬人死亡。輝瑞公司的冷凍電鏡設施負責人說，冷凍電鏡對該項目的進展起到了很大作用。為了生產這種疫苗，輝瑞公司的科學家在病毒表面表達了一種糖蛋白，以幫助它穿過細胞膜，引起感染。研究人員創建了360種穩定形式的融合蛋白，並篩選了它們刺激抗體反應的潛力。他們用冷凍電鏡研究了候選蛋白是如何與抗體相互作用的，以找到理想形式的疫苗。這種融合蛋白疫苗已於今年年初進入III期臨床試驗。但是，許多候選藥物都是小分子，而非蛋白質。這時候2 Å以下的解析度可能會更有價值，研究人員可以進行基於結構的藥物設計。例如，總部位於英國劍橋的藥物公司Astex Pharmaceuticals開始用冷凍電鏡篩選結合靶點蛋白的有機小分子，希望從小分子庫裡可以找到與目標蛋白產生最強相互作用的功能基團。然後，他們將這些功能基團中的幾個拼湊在一起，成為有前途的候選藥物，這是一種基於片段的藥物設計策略（fragment-based drug design）。Astex Pharmaceuticals長期以來一直在用X射線晶體學來做藥物篩選，但他們剛剛買了Krios冷凍電鏡，並期望這項技術可以推動他們的研究。在去年發布的一項研究中，該公司篩選了針對靶蛋白丙酮酸激酶2（pyruvate kinase 2）的化合物片段。顯然，用冷凍電鏡來做這件事情比我們用X射線晶體衍射要慢得多，但這只是一個開始，Astex Pharmaceuticals公司的CEO說。事實證明，冷凍電鏡是解析SARS-CoV-2的重要工具。今年早些時候，研究人員用該方法快速確定了病毒的spike蛋白結構，該結構有助於其進入細胞。spike蛋白是開發疫苗的主要目標。其他人正在使用冷凍電鏡研究為什麼SARS-CoV-2的傳播力這麼強。赫爾辛基大學的Sarah Butcher是芬蘭的冷凍電鏡實驗室負責人，該團隊最近發現了一種細胞受體在病毒感染中發揮了關鍵的作用。該小組現在計劃研究病毒蛋白如何與細胞受體相互作用。紐約結構生物學中心的Bridget Carragher參與了9個COVID-19項目，該項目正在研究spike蛋白和抗體之間的相互作用，並著眼於疫苗開發。還有更多的項目正在研究候選藥物與病毒的酶之間的相互作用。MRC分子生物學實驗室的Sjors Scheres說，冷凍電鏡為SARS-CoV-2的研究提供了新的手段，其中一些研究是X射線晶體是不可能實現的。儘管取得了如此重大的突破，MRC分子生物學實驗室的Christopher Russo認為，冷凍電鏡高昂的成本仍然阻礙了它的發展。Christopher正在與諾貝爾獎獲得者 Richard Henderson合作，發明了一種小型的顯微鏡，其成本更低。他們降低成本的方法是——降低儀器的工作電壓。當今的商業冷凍電鏡通常以約300 keV發射電子，電子具有足夠的動量，可以提供高質量的數據。儀器製造商們也在朝著特定的方向開發新的冷凍電鏡。但是，300 keV真的是最佳選擇嗎？Christopher Russo和他的同事們重新分析了如何從蛋白質上獲得最佳的數據，同時最大程度減少輻射帶來的損傷。Christopher Russo說，事實證明，所有單顆粒冷凍電鏡工作的最佳電壓約為100 keV，而不是我們一直用的300 keV，這個發現令人震驚。由MRC分子生物學實驗室的Richard Henderson和Christopher Russo開發的100 keV冷凍電鏡比其他冷凍電鏡更便宜，使用的電壓更低。圖源：MRC分子生物學實驗室
Christopher Russo的團隊隨後製造了一臺100 keV的冷凍電鏡，並用它在一周內獲得了5個蛋白的結構，解析度達3.4 Å。與電壓更高的冷凍電鏡相比，100 keV顯微鏡的體積更小，運行成本更低，需要的安全設備更少。Christopher曾希望說服顯微鏡製造商，讓他們製造適用於確定蛋白質結構的100 keV冷凍電鏡系統，但到目前為止他還沒有成功。他說：「商家們正在賣勞斯萊斯，但我們只想要福特。」 因此，他的團隊正在構建自己的100 keV冷凍電鏡，該冷凍電鏡配備了優化的新零件，價格低於100萬美元，相信會讓更多的科研人員有機會接觸到這項革命性技術。撰文 | Leon
責編 | 雪月
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscentsci.0c01048