骨生物學進展:含有miR-218-5p的真皮外秘體通過調節B-catenin信號通路促進毛髮再生

Dermal exosomes containing miR-218-5p promote hair regeneration by regulating β-catenin signaling

 

作者: Shiqi Hu, Zhenhua Li, Halle Lutz, Ke Huang, Teng Su, Jhon Cores,  Phuong-Uyen Cao Dinh, Ke Cheng(Department of Molecular Biomedical Sciences and Comparative Medicine Institute, North Carolina State University, Raleigh, NC 27607, USA. Joint Department of Biomedical Engineering, University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, NC 27599, and North Carolina State University, Raleigh, NC 27606, USA.)

發表情況：Science Advances 24 Jul 2020:Vol.6, no.30, eaba1685   DOI:10.1126/sciadv.aba1685

儘管米諾地爾酊（局部毛細血管擴張劑）和非那雄胺（抗雄藥物）是治療脫髮的「黃金準則」，植髮也能在一定程度上改善人們的「窘況」，但是前者療效不佳，而後者則無異於拆東牆補西牆，甚至還可能讓本就不「富裕」的頭頂雪上加霜。目前脫髮傳統幹預方法包括藥物幹預和植髮手術，藥物幹預起效慢，持續使用時間較長，對身體有副反應；植髮手術研究雖取得較大進展，但供區不足，手術時間長且效率低，易給患者增加痛苦及副反應多，特別是對於終末期脫髮幹預效果不盡人意且費用較高。因此，尋找更加有效幹預脫髮方法迫在眉睫。

1. DP（真皮乳頭間葉細胞）球體在體外增強β-catenin、CD133和Ki67的表達且能夠在體內移植存活，促進C57BL/6小鼠背部毛髮再生。

2. 證實2DDP細胞和3DDP細胞分泌體和miRNAs差異表達的重要性以及3DDP細胞或3DDP-XO促進毛髮再生的可能機制。

毛囊周期從休止期到生長期是調控毛髮再生的關鍵。真皮乳頭間葉(DP)細胞支持毛髮生長並調節毛髮周期。然而，隨著培養的進行，它們逐漸失去了關鍵的誘導特性。DP細胞經球體培養後可部分恢復其促進毛髮再生的能力。在這項研究中，結果表明，與單純的DP細胞或米諾地爾處理相比，DP球體能有效地誘導毛囊周期從休止期向生長期的發展。由於旁分泌信號在這一過程中的重要性，我們從DP細胞培養中分離出分泌體和外泌體，並對它們的治療效果進行了研究。我們發現miR-218-5p在DP球體衍生的外泌體中顯著上調。Western blot和免疫螢光成像顯示，DP球體分泌的外秘體上調β-catenin，促進毛囊的發育。

       

The progression in the hair follicle cycle from the telogen to the anagen phase is the key to regulating hair re-growth. Dermal papilla (DP) cells support hair growth and regulate the haircycle. However, they gradually lose key inductive properties upon culture. DP cells can partially restore their capacity to promote hair regrowth after being subjected to spheroid culture. In this study, results revealed that DP spheroids are effective at inducing the progression of the hair follicle cycle from telogen to anagen compared with just DP cell or minoxidil treatment. Because of the importance of paracrine signaling in this process, secretome and exosomes were isolated from DP cell culture, and their therapeutic efficacies were investigated. We demonstrated that miR-218-5p was notably up-regulated in DP spheroid–derived exosomes. Western blot and immunofluorescence imaging were used to demonstrate that DP spheroid–derived exosomes up-regulated b-catenin, promoting the development of hair follicles.

圖1  3D-DP球體的製備與特徵

（A）從毛囊中分離小鼠毛囊乳頭(DP)細胞。比例尺，500um。(B)常規培養可使2D DP細胞生長。比例尺，50um。(C)超低黏附培養瓶中DP球體的生長。比例尺，100um。(D)球體CD133(綠色)和β-catenin(紅色)雙重染色。比例尺，100um。(E和F)掃描電子顯微鏡(SEM)圖像的角蛋白(E)和3D球形加載的角蛋白。(F)一個明顯的橢球體以黃色突出顯示。比例尺，100um。(G)說明用於細胞滯留研究的小鼠背部注射部位的示意圖。(H)如(G)所示，小鼠被剃毛並以不同配方注射在背部皮膚上。用DID標記細胞，利用 PBS或角蛋白作溶劑進行皮內注射。在不同時間點拍攝活體成像系統(IVIS)圖像。(I)IVIS圖像的量化。數據顯示均值±SD，n=3隻小鼠。3D球體/角蛋白的保留時間最長。

圖2  比較5%米諾地爾酊溶液局部塗抹治療與注射2D-DP細胞或3D球體對毛囊期的影響

 

(A)一隻去毛小鼠的治療側(左)和未處理側(右)的圖示。(B)不同處理後β-catenin在處理部位和未處理部位的表達情況。(C)顯示不同處理後CD133在處理部位和未處理部位的表達的代表性圖像。(D)顯示不同處理後Ki67在處理部位和未處理部位的表達的代表性圖像。比例尺，100um。(E~G) β-連環蛋白陽性(B-連環蛋白+)(E)、CD133+(F)和Ki67+(G)細胞的定量。粉紅色表示已處理的位置，灰色表示未處理的位置。N=5，N.S.，無顯著差異；*P<0.001，**P<0.01，*P<0.0001。

圖3  C57BL/6小鼠背毛生長實驗

 

（A) 觀察毛髮覆蓋情況。將小鼠分為5組(n=5)，左半側給藥。分別於第0、10、15、20天對小鼠進行拍照。(B)第10天、第15天和第20天毛髮覆蓋率的量化統計圖。記錄了左側(治療)和右側(未治療)部位。N=5，N.S.，差異不顯著；*P<0.001，**P<0.01，*P<0.05。圖片來源：S.H.，北卡羅來納州立大學。

圖4  不同的治療方法的Western blotting和免疫組織學

（A) Western blot分析第20天背部皮膚β-catenin、p-ERK1/2、ERK1/2、SFRP2和GAPDH蛋白含量。(B)分組定量Western blot蛋白水平。n=3。(C)不同處理組皮膚樣本中SFRP2和β-catenin的免疫螢光共染色。比例尺，100mm。(D)SFRP2相對表達量的量化統計。(E)B-catenin相對表達量的測定。N=5.N.S.，無顯著差異；*P<0.0001，**P<0.01，*P<0.05。

圖5  2D DP細胞和3D DP球體的分泌體

(A) 示意圖說明DP球體如何通過細胞因子和外泌體的遷移和分泌促進毛髮周期從休止期向生長期的轉變（原文此處有錯）。在生長期，生長DP細胞的豐富來源在毛囊突起內。DP細胞數量在退變過程中下降。DP細胞的補充促進了生長期的開始。(B至E)2D DP-XO和3D DP-XO的表徵。(B)TEM圖像。外秘體被用黃色箭頭表示。比例尺，500um。(C)納米級的尺寸分布。(D)與2D DP-XO相比，3D DP-XO的前10個上調miRNAs和10個下調的miRNAs。(n=3個生物樣本，每個生物樣本有n=3個技術樣本)。（E)說明FGF2和TIMP2驅動的毛囊調節和miR-218-5P誘導的毛囊發育的示意圖。

圖6  外泌體治療法對背部毛髮再生的影響

(A)將小鼠分為3組(n=4)，左側給藥。分別在第10天和第15天對小鼠進行拍照。(B)不同組別的相應毛髮覆蓋率分析。左右兩側均進行記錄。3DDP-XOS比米諾地爾和2DDP-XOS更有效地促進毛囊生長。N=4，*P<0.001，**P<0.01，*P<0.05。(C)不同處理組皮膚樣本中SFRP2(綠色)和B-catenin(紅色)的免疫螢光共染色。細胞核用DAPI(4『，6-二氨基-2-苯基吲哚)(藍色)染色。比例尺，100um。(D)SFRP2相對表達量的量化。N=5；*P<0.0001。(E)分別在注射陰性對照、miR-218-5p類似物和抑制劑後第20天對有代表性的小鼠進行成像。紅色圓圈表示注射斑點。注射部位有一個小禿點，說明投放方式需要進一步改進。(F)三組第15天毛髮覆蓋率(%)的量化。n=4；*P<0.05和**P<0.01。(G)miR-218-5p上調外秘體和miR-218-5p類似物通過體內JetPEI可將miR-218-5p轉染到靶向sFRP2，從而上調Wnt/β-catenin通路，miR-218-5p抑制劑將在一定程度上阻斷這一信號轉導。圖片來源：S.H.，北卡羅來納州立大學。

目前脫髮治療中，非那雄胺和米諾地爾的療效明確但是需要持續使用，一旦停用將導致脫髮再次發生，植髮價格昂貴且對患者原有的頭髮資源要求較高，因此我們迫切需要找到新的療法來預防脫髮和促進頭髮再生，從根本上解決問題。該文章證明了miR-218-5p過表達的外秘體加速了毛髮的生長期的發生，球體培養為細胞治療提供了一條潛在的途徑。miR-218-5p通過下調Wnt信號抑制劑SFRP2，從而促進B-catenin，形成正反饋循環，從而促進毛囊的發育。與目前的毛髮再生實踐相比，我們的研究可能提供以下優勢：對於不適合做植髮手術的人，他們可以受益於通過微創方法給予因子和外泌體，例如，無針注射，微針貼片和噴霧劑。與商品化的米諾地爾酊溶液相比，外秘體是一種副作用較少的天然產品，而且由於脫髮的複雜性，細胞療法或分泌物療法在治療脫髮方面可能更具優勢。總體而言，這裡概述的研究可能代表了頭髮治療的新治療策略。