文章信息
1.研究背景
miR-125a-5p在肝細胞癌（HCC）和其他癌症中是一種腫瘤抑制因子，但在HCC腫瘤發生過程中其作用機理仍然未知。
2.方法
2.1 來自HCC患者的8對肝癌組織和鄰近正常組織使用miRNA晶片（Shanghai Wcgene Biotech, Shanghai, China）比較miRNA的表達情況
2.2 細胞轉染，對轉染後的細胞進行qRT-PCR分析，CCK8和菌落形成試驗，Western blot分析，以及免疫螢光分析。
2.3 利用資料庫預測miR-125a-5p的靶基因
2.4 建立小鼠腫瘤模型
3.結果
3.1 miR-125a-5p在HCC組織和細胞系中下調
使用微陣列比較八對HCC組織和鄰近正常組織中的miRNA表達。結果表明，與鄰近的正常組織相比，HCC組織中的miR-125a-5p表達降低。此外，qRT-PCR表明miR-125a-5p在HCC細胞系（Bel-7404，SK-Hep1，Bel-7404和MHCC-97H）中的表達低於正常肝細胞系（L02）。
圖1. （A）在八對匹配的HCC組織和相鄰正常組織中差異表達的miRNA的熱圖。（B）qRT-PCR表明，與鄰近的正常組織相比，HCC組織中的miR-125a-5p表達下調。（C）與Starbase中TCGA中相鄰的正常組織相比，HCC腫瘤組織中的miR-125a-5p表達下調。（D）qRT-PCR表明，miR-125a-5p在HCC細胞系（Bel-7404，SK-Hep1，Bel-7404和MHCC-97H）中的表達低於正常肝細胞系（L02）。（E）Kaplan-Meier曲線表明，HCC患者的總體生存率與miR-125a-5p表達水平無關。
3.2 miR-125a-5p在體外抑制HCC細胞增殖並誘導其凋亡
分別通過用miR-125a-5p模擬物和抑制劑轉染，在Bel-7404和SK-Hep1細胞中過表達和敲低miR-125a-5p。並通過qPCRC，CCK8和菌落形成分析，Western印跡和免疫螢光實驗表明，miR-125a-5p在體外抑制HCC細胞的增殖並誘導其凋亡。
圖2.（A）qRT-PCR顯示，在Bel-7404和SK-Hep1細胞中，miR-125a-5p在用模擬物轉染後被上調，而在抑制劑轉染後被下調。（B和C）使用CCK8和集落形成測定法評估轉染的Bel-7404和SK-Hep1細胞的細胞增殖能力。（D）在Bel-7404和SK-Hep1細胞中轉染後，使用WB分析p53，Bax，Bcl-2和活化的caspase-3的表達。（E）轉染Bel-7404和SK-Hep1細胞後，檢測到caspase底物的免疫螢光染色。
3.3 PTPN1和MAP3K11是HCC中miR-125a-5p的直接靶標
使用三個靶點預測資料庫預測miR-125a-5p的靶標，確定了131個共同要素（圖3A）。結果表明，``JUN激酶活性的激活''是miR-125a-5p的生物學功能，而PTPN1，MAP3K9，MAP3K10和MAP3K11是miRNA的潛在靶標（圖3B和3C）。在本研究的其餘部分中，重點放在PTPN1和MAP3K11上。
圖3.（A）使用三個靶點預測資料庫預測miR-125a-5p的靶標；確定了131個共同要素。（B和C）在Cytoscape中用ClueGO和CluePedia分析了這131個靶基因。（D和F）miR-125a-5p及其在PTPN1和MAP3K11的3'-UTR中的假定結合序列。（E和G）miR-125a-5p的過表達被抑制，而敲低則增加了野生型（WT）的螢光素酶活性，但沒有突變（MT），PTPN1或MAP3K11 3'-UTR。（H）通過Western印跡評估轉染的Bel-7404和SK-Hep1細胞中PTPN1和MAP3K11蛋白的表達。
3.4 PTPN1和MAP3K11上調與肝癌中miR-125a-5p表達負相關
「 JUN激酶活性的激活」與資料庫預測的131個常見元件相關的生物學功能之一，這意味著JNK MAPK信號通路可能對miR-125a-5p的生物學功能至關重要。
圖4.（A和B）在Starbase的TCGA中PTPN1和MAP3K11被上調。（C和D）PTEP1和MAP3K11的高表達與GEPIA資料庫中較差的總體存活率有關。（E和F）qRT-PCR表明，與相鄰的正常組織相比，八對匹配的HCC組織中PTPN1和MAP3K11上調。（G–I）qRT-PCR和蛋白質印跡表明PTPN1和MAP3K11在HCC細胞系中上調。 （J和K）Spearman相關分析表明miR-125a-5p表達與PTPN1和MAP3K11表達負相關。
3.5 miR-125a-5p通過HCC中的MAPK信號通路抑制PTPN1和MAP3K11表達
圖5. （A）Western印跡表明，miR-125a-5p的過表達減少，而miR-125a-5p的敲低增加，在Bel-7404和SK-Hep1細胞中JNK1 / 2/3和c-Jun的表達。（B和C）Western印跡顯示PTPN1和MAP3K11敲低可降低Bel-7404和SK-Hep1細胞中JNK1 / 2/3和c-Jun的表達。
3.6 miR-125a-5p通過MAPK信號通路靶向PTPN1和MAP3K11，從而抑制HCC細胞增殖並誘導其凋亡
圖6. （A-D）使用miR-control，miR-125a-5p抑制劑，PTPN1 siRNA 3或MAP3K11 siRNA 1轉染Bel-7404和SK-Hep1細胞後，使用CCK8和集落形成測定法評估細胞增殖能力。（E和F）在Bel-7404和SK-Hep1細胞中轉染後，檢測到裂解的胱天蛋白酶底物的免疫螢光染色。（G和H）使用Western blot檢測轉染的Bel-7404和SK-Hep1細胞中PTPN1，MAP3K11，JNK1/2/3和c-Jun的表達。
3.7 miR-125a-5p通過體內的MAPK信號通路靶向PTPN1和MAP3K11，從而抑制細胞增殖並誘導凋亡
圖7. （A和B）小鼠和異種移植組織的代表性圖像。（C和D）異種移植組織體積和重量，miR-125a-5p的過表達被抑制，而miR-125a-5p的敲低促進了腫瘤的生長。（E）在人類蛋白圖譜資料庫中，HCC腫瘤組織中PTPN1和MAP3K11的表達高於正常肝組織。（F）通過免疫螢光在400x放大倍數下檢測到Brdu，Ki67，PTPN1，MAP3K11，JNK1 / 2/3和c-Jun表達。miR-125a-5p的過表達減少了增殖細胞的數量並增加了凋亡細胞的數量，而miR-125a-5p的基因敲除具有相反的作用。
結論
我們的發現表明，miR-125a-5p通過MAPK信號通路直接靶向PTPN1和MAP3K11，從而抑制HCC細胞增殖並誘導細胞凋亡（圖8）。因此，單獨或組合使用miR-125a-5p模擬物或JNK信號抑制劑可能是治療HCC的潛在方法。