了解非編碼RNAs（ncRNAs）在腫瘤發生和轉移中的作用，將為鑑定診斷和治療靶點建立新的途徑。2019年5月17日，四川大學華西醫院吳泓、曾勇組在Cancer Research期刊上發表了題為LncRNA SNHG10 facilitates hepatocarcinogenesis and metastasis by modulating its homolog SCARNA13 via a positive feedback loop的研究成果。該研究鑑定出lncRNA SNHG10及其同源snoRNA SCARNA13作為HCC發展和轉移的新驅動因子。揭示了LncRNA SNHG10通過正反饋環調節其同源物SCARNA13促進肝癌發生和轉移的分子機制。
肝細胞癌（HCC）是中國第四大常見惡性腫瘤和第三大癌症死因。然而HCC發生和轉移的分子機制尚未完全闡明，因此鑑定關鍵的促癌分子將有助於理解HCC發病機制和鑑定潛在的治療靶點。近年來，lncRNAs和小RNAs之間的複雜相互作用被揭示，其中一些lncRNAs可以產生或調節小RNAs。SNHGs（小核仁RNA宿主基因）的初級RNA轉錄本內含子在細胞核內可被加工成snoRNAs，而外顯子被剪接成lncRNAs並轉運到細胞質中，表明snoRNAs與SNHGs轉錄的同源lncRNAs之間可能存在潛在的相關性。然而，這些lncRNAs和同源snoRNAs之間的特定關係以及它們在腫瘤發生中的特定作用卻知之甚少。
1、SNHG10和SCARNA13在肺轉移灶和HCC組織中高表達，與HCC患者預後不良有關
為了鑑定參與HCC轉移的ncRNA，研究人員利用RNA-seq比較異種移植的HCC細胞和親本HCC細胞之間的表達譜，並進一步通過TCGA LIHC資料庫分析以及交叉分析鑑定出24個lncRNAs和6個snoRNAs可能在HCC的腫瘤發生和轉移中起關鍵作用。其中SNHG10和SCARNA13是來自相同初級RNA轉錄本的不同產物。更具體地，SCARNA13是由SNHG10基因的初級RNA轉錄本內含子加工而成，而外顯子被剪接到SNHG10轉錄本中，表明SNHG10和SCARNA13可能協同促進HCC的發生和進展。因此，重點專注於lncRNA SNHG10及其同源物SCARNA13。
隨後，研究人員通過對TCGA LIHC資料庫分析以及對臨床64對HCC組織及其相鄰正常組織中SNHG10和SCARNA13的表達水平進行了檢測。發現與鄰近正常組織相比，HCC組織中SNHG10和SCARNA13的水平均升高，並且它們之間存在統計學上的正相關。此外，Kaplan-Meier分析顯示SNHG10或SCARNA13的高表達與總體生存率較差顯著相關。
接著，在HCC細胞系中過表達或敲低SNHG10會導致SCARNA13的表達顯著的增加或減少，而SCARNA13的缺失不影響SNHG10的表達。表明SNHG10可能是SCARNA13的上遊調控因子。
2、SNHG10和SCARNA13促進HCC細胞的腫瘤發生和轉移
為了闡明SNHG10在肝癌發生和轉移中的致癌作用，研究人員檢測了SNHG10對細胞表型的影響。發現SNHG10的缺失顯著抑制HCC細胞周期和增殖，並誘導細胞凋亡。此外，SNHG10的沉默大大減弱了HCC細胞的侵襲和遷移能力。
進一步的體內實驗發現：與對照組相比，SNHG10缺失組中腫瘤的體積和重量顯著降低，表明SNHG10在體內可增強HCC細胞的致瘤性。此外，研究人員評估了SNHG10對HCC細胞轉移的促進作用。通過肝/肺轉移檢測發現LV-shSNHG10組小鼠的肝/肺轉移結節的螢光素酶信號強度顯著下降，表明SNHG10增強了HCC細胞的肝/肺轉移潛能。HE染色顯示LV-shSNHG10組的轉移灶在肺和肝組織切片中顯著降低。而過表達SNHG10則得到相反的結果。表明SNHG10在HCC腫瘤發生和轉移中起致癌驅動因子的作用。
由於SCARNA13和SNHG10在HCC組織中同時上調。同樣地，研究人員發現與SNHG10相似，SCARNA13的敲低極大地抑制了細胞周期和增殖，並誘導了HCC細胞的凋亡。此外，SCARNA13的下調顯著損害了HCC細胞的侵襲和遷移能力。這些結果將SCARNA13鑑定為HCC中的致癌啟動子。
3、轉錄因子c-Myb上調SNHG10和SCARNA13水平
為了確定SNHG10和SCARNA13在HCC中表達升高的潛在機制，研究人員通過資料庫鑑定了9個可能與SNHG10基因啟動子區域結合的TFs。隨後，TCGA LIHC數據集的分析表明，在9個TFs中，c-Myb表達與SNHG10和SCARNA13表達的相關性最高。因此，推斷c-Myb可能導致SNHG10和SCARNA13表達升高。正如預期一樣，敲低c-Myb可顯著降低HCC細胞中SNHG10和SCARNA13的表達，表明c-Myb是SNHG10和SCARNA13的上遊調節因子。
接著，生物信息學分析預測了SNHG10啟動子區域有5個c-Myb結合位點（MBS）。隨後的ChIP實驗證實了c-Myb顯著富集在SNHG10啟動子區域中的MBS1和MBS3上。為了進一步確定SNHG10基因啟動子上c-Myb的轉錄激活，用SNHG10啟動子螢光素酶報告基因和c-Myb siRNA共轉染細胞。發現c-Myb的缺失顯著降低了SNHG10啟動子活性。這些數據表明c-Myb可以直接結合SNHG10的啟動子區域，導致HCC細胞中SNHG10和SCARNA13的上調。
4、SNHG10作為miR-150-5p海綿可增加c-Myb表達
從理論上來看，snoRNAs和同源lncRNAs分別位於細胞核和細胞質中。FISH實驗（FISH探針/試劑盒由銳博生物提供）也證實了SNHG10主要定位於細胞質中，而SCARNA13優先位於細胞核中。接下來，研究人員探索了SNHG10調節SCARNA13表達的具體機制。生物信息學分析表明miR-150-5p可以結合SNHG10的309-315nt位點。RIP實驗顯示miR-150-5p和SNHG10在Ago2免疫沉澱物中均顯著富集，表明SNHG10存在於基於Ago2的miRNA誘導的抑制複合物中，並與miR-150-5p相關。
隨後，針對SNHG10設計10個ChIRP探針（ChIRP探針設計合成由銳博生物提供），通過ChIRP實驗以確定SNHG10和miR-150-5p之間的直接相互作用。結果發現miR-150-5p強烈富集在SNHG10上。此外，miR-150-5p mimic顯著抑制了pmirGLO-SNHG10的螢光素酶活性，而突變型則無影響，證實了SNHG10對miR-150-5p具有海綿作用。
大量研究表明c-Myb是miR-150-5p的直接靶點，miR-150-5p過表達可使c-Myb mRNA和蛋白水平下調。而之前的研究證明c-Myb可以直接上調SNHG10的表達。基於SNHG10對miR-150-5p的海綿作用，研究人員推斷SNHG10介導的miR-150-5p的螯合可能對c-Myb的上調至關重要。進一步實驗發現上調SNHG10後，c-Myb的表達增加，而miR-150-5p mimics完全消除了這一效應。相反，SNHG10敲低後，c-Myb的表達下降並被miR-150-5p海綿徹底挽救。
這些研究結果表明，SNHG10作為miR-150-5p的海綿，可以降低其對c-Myb的抑制作用，進而增強c-Myb的表達。此外，SNHG10和c-Myb可能形成正反饋環以維持HCC中SNHG10的高表達。
5、SNHG10通過miR-150-5p/RPL4-c-Myb正反饋環調節SCARNA13的表達
為了闡明c-Myb是否在SNHG10對SCARNA13的調節作用中不可或缺，研究人員進行了挽救實驗。發現與對照相比，LV-SNHG10細胞中SCARNA13的表達顯著升高，當轉染c-Myb siRNA後，SCARNA13的表達仍高於對照，暗示SNHG10可能不僅僅通過調節c-Myb的表達來調節SCARNA13。miR-150-5p inhibitor可使LV-Control細胞中SCARNA13的表達顯著升高，當共轉染miR-150-5p inhibitor和c-Myb siRNA後， SCARNA13的表達無明顯變化，證實了c-Myb完全介導了miR-150-5p對SCARNA13表達的調控作用。因此，可以看出c-Myb的表達水平是SNHG10過表達導致SCARNA13上調的部分原因。
為了驗證SNHG10結合的mRNA是否會調節c-Myb的功能活性，研究人員通過下拉SNHG10結合的內源性mRNAs，並進行ChIRP-seq分析，最終發現RPL4與SNHG10具有顯著相關性。之前研究表明RPL4與c-Myb相互作用，並正向調節c-Myb的轉錄活性。此外，敲低SNHG10可使RPL4的表達顯著降低。因此，推斷SNHG10可能通過影響HCC細胞中RPL4 mRNA的穩定性來調控c-Myb的功能活性。接著，研究人員首先利用ChIRP-qPCR證實了RPL4 與SNHG10的相互作用。並進一步發現過表達SNHG10可延長RPL4 mRNA的半衰期，從而影響其穩定性。
接下來，為了評估RPL4對HCC細胞中c-Myb功能活性的正調節作用，構建了含有c-Myb識別元件（MREs）的螢光素酶報告基因，發現RPL4可以增強MREs的活性。此外，Co-IP測定確定了RPL4與c-Myb之間的相互作用。最後，進一步的挽救實驗證明，轉染c-Myb siRNA和RPL4 siRNA後，LV-SNHG10細胞中SCARNA13的表達沒有發生統計學變化。
研究結果表明SNHG10一方面通過吸附miR-150-5p，另一方面通過與RPL4相互作用增強c-Myb的轉錄活性來促進c-Myb的表達，從而調節SCARNA13的表達。
6、SCARNA13通過調節SOX9介導SNHG10驅動HCC細胞增殖、侵襲和遷移
基於SNHG10和SCARNA13協同促進HCC細胞的惡性表型和SNHG10調節SCARNA13的表達，可以推斷出SNHG10對HCC細胞的腫瘤促進作用可能是由SCARNA13介導的。因此，SCARNA13 ASO轉染LVSNHG10細胞顯著挽救了SNHG10過表達對細胞增殖、侵襲和遷移的影響。這些結果表明，SCARNA13介導了SNHG10的腫瘤促進功能。
為了深入了解SCARNA13在HCC中的致癌作用分子機制，對SCARNA13敲低的HCC細胞進行了RNA-seq和定量蛋白質組學分析。發現沉默SCARNA13後，分別有188個和275個基因表達下調和上調，還發現了182個差異表達的蛋白。通過交叉篩選出11個基因，其中SCARNA13敲低後SOX9的表達下降最為顯著。此外，敲低SCARNA13後，CDK2、CDK3、Cyclin D1、Cyclin D3、ZEB1、Vimentin、N-cadherin和纖連蛋白的表達水平呈現統計學上的下降趨勢。相反，SCARNA13 ASO轉染導致HCC細胞中p21、p27和E-cadherin的表達顯著增加。總之，這些發現表明SNHG10對腫瘤發生和轉移的促進作用是由SCARNA13介導的，SCARNA13通過上調SOX9在HCC細胞中促進細胞周期和EMT。
原文：Lan T, Yuan K, Yan X, et al. LncRNA SNHG10 facilitates hepatocarcinogenesis and metastasis by modulating its homolog SCARNA13 via a positive feedback loop[J]. Cancer research, 2019: canres. 4044.2018.
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