責編 | 酶美
三陰乳腺癌（Triple Negative Breast Cancer, TNBC）仍然是癌症治療的難題。已有的研究表明，與Luminal A/B亞型或HER+亞型的乳腺癌患者相比，TNBC亞型的免疫原性更強，說明TNBC患者更可能從免疫治療中受益，但免疫檢查點抑制劑PD-1和PD-L1單抗對三陰乳腺癌的單藥療效較低【1】。這說明在三陰乳腺癌細胞與微環境相互作用的過程中，有許多因素制約著激活的T細胞對腫瘤的殺傷作用。對這些制約因素的深入挖掘並予以幹預，可以極大提高T細胞免疫治療的療效，造福於患者。
細胞自噬（autophagy）貫穿於乳腺癌的演進過程中，它是一種進化上相對保守的蛋白質降解方式，主要用來降解長半衰期的蛋白和細胞器。但這種機制如何激活或限制免疫系統中T淋巴細胞對腫瘤細胞的攻擊到現在為止依然沒有被人們很好地理解。
在既往的研究中，中山大學腫瘤防治中心朱孝峰研究組和國外研究組曾分別報導了自噬基因ULK1與Beclin 1在乳腺癌中的蛋白表達水平低【2,3】，並且Beclin 1 mRNA水平的低下可成為TNBC患者獨立的預測指標【4】。因此從一定程度上說，即使外界因素誘導乳腺癌細胞發生自噬，其細胞自噬的能力也是相對低下的，這種現象可能在TNBC患者中更明顯。為了探討自噬在T細胞攻擊三陰乳腺癌細胞中所發揮的作用，作者展開了一系列的研究。
近日，中山大學腫瘤防治中心鄧蓉/朱孝峰/唐軍合作在Nature Communications發文題為Autophagy Deficiency Promotes Triple-Negative Breast Cancer Resistance to T Cell-Mediated Cytotoxicity by Blocking Tenascin-C Degradation的研究成果。該研究揭示自噬缺陷在三陰乳腺癌細胞實現逃逸T細胞免疫攻擊中發揮了重要作用，並鑑定了Tenascin C是自噬缺陷導致T細胞免疫耐受的關鍵靶點，為三陰乳腺癌免疫耐受提供了新的治療策略。
該研究首先明確了自噬缺陷的TNBC細胞對T細胞免疫殺傷的耐受現象。作者利用CRISPR-Cas9技術或RNAi技術敲除或幹擾Atg5，Atg7 和Beclin 1等自噬相關基因的表達，構建自噬缺陷的TNBC細胞模型和小鼠移植瘤模型，觀察激活的T淋巴細胞對自噬能力不同腫瘤細胞的殺傷作用。
結果發現自噬缺陷的TNBC細胞能逃逸T細胞的免疫攻擊，並觀察到自噬缺陷的4T1腫瘤細胞成瘤能力顯著增強，且浸潤性T細胞的數量和活性顯著降低。Tumor Immune Estimation Resource(TIMER)網站生信數據分析也顯示Atg5和Beclin 1的mRNA表達只在Basal-like 型乳腺癌中與TIL細胞的浸潤成正相關。
為了找到與自噬缺陷相關的免疫抑制分子，作者結合SILAC蛋白標記技術與GSEA通路分析野生型和自噬缺陷型TNBC腫瘤細胞的蛋白表達差異，採用基因優化原則，篩選出受自噬調控的關鍵免疫抑制分子細胞外基質蛋白Tenascin-C(TNC)。
進一步研究證實在自噬缺陷的TNBC細胞中，TNC蛋白水平顯著上調；敲低TNC能回復自噬缺陷TNBC細胞對T細胞殺傷的敏感性，且對T細胞的增殖抑制作用減弱；而且TNC敲除後，自噬缺陷4T1腫瘤細胞移植瘤中浸潤性T細胞的數量和活性顯著降低，腫瘤生長速度顯著減緩。
接下來作者闡明了TNC 蛋白在自噬缺陷的TNBC細胞中高表達的分子機制。自噬溶酶體途徑是真核細胞重要的降解途徑之一。選擇性自噬-溶酶體降解途徑異常與腫瘤的關係多有報導。在研究中，作者發現飢餓誘導自噬使野生型TNBC細胞的TNC蛋白水平明顯下降，但自噬缺陷細胞中TNC降解被阻斷。這提示TNC可能通過自噬溶酶體途徑發生降解。
進一步研究表明，E3泛素連接酶Skp2能介導TNC蛋白的Lys942和Lys1882位點發生K63型泛素化標記，促使TNC蛋白通過其FN3結構域與自噬受體蛋白P62的UBA（Ubiquitin-Associated binding domain）結構域在胞內發生結合。
於是受體蛋白P62一方面將待降解的底物蛋白TNC拉到自噬泡附近，一方面通過其LIR（LC3-interacting region）基序與自噬泡上的ATG8/LC3結合，使TNC最終在溶酶體被選擇性降解。而在自噬缺陷的TNBC細胞中，TNC 蛋白由於不能通過選擇性自噬-溶酶體途徑發生降解，導致其表達顯著增高。
由於大多數TNBC患者對免疫檢查點抑制劑無效或不敏感，因此提出新的免疫聯合治療策略具有重要意義。根據以上實驗，作者提出猜想，自噬缺陷的TNBC細胞高表達TNC可能會抑制免疫檢查點抑制劑的療效。
於是作者首先做了一系列生信分析及免疫組化分析，進一步明確TNC的臨床應用價值。利用KM plotter資料庫，作者發現在ER-的乳腺癌患者，尤其是basal-like型患者中，TNC的mRNA水平高表達，其無復發生存率（RFS），總生存期（OS），無遠處轉移生存期(DMFS)，進展後的生存期（PPS）更低。
進一步的免疫組化分析顯示，TNC蛋白高表達是TNBC患者不良的獨立預後因素，且與LC3B表達呈負相關，與CD8+ T細胞腫瘤浸潤呈顯著負相關。接下來作者在自噬缺陷的TNBC細胞模型和小鼠移植瘤模型上聯用了免疫檢查點抑制劑和靶向TNC的治療。結果發現，TNC單抗與anti-PD1/anti-PDL1聯用比單藥能顯著增強T細胞對自噬缺陷TNBC細胞的殺傷作用；發現誘導性敲低TNC能夠增強PD1單抗對自噬缺陷4T1移植瘤的治療效果。
總的來說，該研究從自噬的角度探討如何提高TNBC患者對T細胞免疫治療的反應，為研究腫瘤自噬與免疫微環境的相互作用提供了新視野。該研究還明確靶向TNC能增強免疫檢查點抑制劑對自噬缺陷腫瘤的療效，為TNBC患者提供了具有應用前景的治療策略。
中山大學腫瘤防治中心博士研究生李智玲、博士後張海亮、博士研究生黃昀為該論文共同第一作者；中山大學腫瘤防治中心鄧蓉副教授、朱孝峰教授、唐軍主任醫師為該論文共同通訊作者。
參考文獻
1 Keenan, T. E. & Tolaney, S. M.Role of Immunotherapy in Triple-Negative Breast Cancer.J Natl Compr Canc Netw18,479-489, doi:10.6004/jnccn.2020.7554 (2020).
2 Tang,J. et al. Low expression of ULK1 isassociated with operable breast cancer progression and is an adverse prognosticmarker of survival for patients. Breastcancer research and treatment134,549-560, doi:10.1007/s10549-012-2080-y (2012).
3 Liang,X. H. et al. Induction of autophagyand inhibition of tumorigenesis by beclin 1.Nature402, 672-676,doi:10.1038/45257 (1999).
4Tang,H. et al. Decreased BECN1 mRNAExpression in Human Breast Cancer is Associated with Estrogen Receptor-NegativeSubtypes and Poor Prognosis.EBioMedicine2, 255-263,doi:10.1016/j.ebiom.2015.01.008 (2015).