為什麼要對蛋白質進行降解?
現代質譜儀能夠以相當高的精度測定完整蛋白質的分子量。那麼我們為什麼不簡單地通過測量完整蛋白質的質量來進行蛋白質組學分析呢?而是通過蛋白降解技術將大的蛋白質片段降解為小的多肽片段呢?
有三個主要原因:1,儘管質譜(MS)儀器很好用,但它們產生的測量結果仍有誤差。蛋白質的質量越大,誤差的絕對值就越大。這些誤差造成的較高不確定性,使得測量結果不夠精確,無法進行準確識別。此外,不同的翻譯後修飾使基於質量的賦值更加複雜。2,並不是所有的蛋白質都能經得起完整的質量測定,比如對質量很大的疏水性蛋白質進行質量測定就非常困難。3,完整蛋白質質量測定的靈敏度不如肽質量測定和肽串聯質譜分析的靈敏度。由於這些原因,目前通過分析完整的蛋白質來進行蛋白質組學研究是不太現實的。
關於為什麼選擇分析多肽而不分析蛋白質還有另外兩個原因。首先,現代質譜儀可以對多肽進行高精度的質量測定,還可以獲得相關數據,從而確定肽的序列,質譜儀非常適合用於分析肽。其次,從多肽質譜分析中獲得的數據可以直接與從蛋白質和核苷酸序列資料庫中獲得的蛋白質序列進行比較。通過比較肽質譜數據和資料庫信息來確定蛋白質特性的這種搜索算法的一個關鍵因素是要了解某些蛋白水解酶在特定的位點將蛋白質降解成多肽。
理想的蛋白質降解技術是在特定的胺基酸殘基上切割蛋白質,產生與質譜分析最相容的片段。一般來說,長度約為6-20個胺基酸的肽片段是質譜分析和資料庫比較的理想選擇。短於約6個胺基酸的肽通常太短,無法在資料庫搜索中產生唯一的序列匹配。另一方面,在串聯質譜分析中,很難從超過20個胺基酸的肽中獲得序列信息。因此,蛋白質降解的目標是為質譜分析生產儘可能多且長度最佳的肽。
蛋白質降解技術常用蛋白酶有哪些?
自然界中已經進化出各種各樣的蛋白酶來完成對高等生物進行蛋白質重塑這個任務,當然這個過程基本上是永無止境的。蛋白質組學分析中真正需要的是那些穩定、特性良好和具有明確特異性的酶。這些酶必須具有一定的數量和高純度,並且必須足夠穩定,可以在各種情況下應用。目前,有不少能滿足這些要求的蛋白酶已被用於蛋白質組分析中。上表中總結了蛋白質組分析中最廣泛使用的蛋白酶及其裂解特性。下期文章中,小編會對表中的各種蛋白酶的主要特性做概述。
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百泰派克生物科技基於質譜,提供蛋白質質譜鑑定/質譜分析服務:樣品前處理-蛋白還原烷基化後使用高度特異性的蛋白酶進行蛋白樣品水解,獲得多肽片段;上機分析-通過納升級色譜(nano-flow)結合高解析度質譜,在最高的靈敏度下對肽段進行分離並使用超高解析度質譜儀採集肽段質譜數據;資料庫檢索-結合樣品物種對應的蛋白質資料庫對成千上萬張質譜圖進行分析(使用Uniprot資料庫,每月更新一次資料庫,以確保訪問最新數據),從而實現樣品中蛋白的蛋白質質譜鑑定。