對亞硝酸鹽含量檢測的確定與方法驗證
■文/馬曉君
亞硝酸鹽廣泛存在於土壤、水、蔬菜及醃製的動物性食品中,也是廣泛存在於自然環境中的化學物質。自然界中的很多食物，包括糧食、蔬菜、魚類、蛋類、肉類中都含有亞硝酸鹽。蔬菜是人們日常生活中攝入量最多的，也是一種易於富集硝酸鹽的植物性作物。
據國際糧農組織1990年統計，人體所需的90%維生素C、60%維生素A均來自蔬菜，蔬菜提供人體所需維生素的同時，也提供了進入人體80%～90%的硝酸鹽。現代醫學證明，雖然硝酸鹽對人體沒有直接毒害作用，但過量的硝酸鹽進入人體後，在一些酶和微生物作用下可轉變為有毒的亞硝酸鹽。亞硝酸鹽是強氧化劑，進入血液與血紅蛋白結合，使氧合血紅蛋白變為高鐵血紅蛋白，從而失去攜氧能力,導致組織缺氧，而出現一系列缺氧的中毒病症，嚴重時可使人死亡。另外，亞硝酸鹽對血管有擴張作用，它還可與胃中的次級胺結合形成致癌物質亞硝酸胺，引起消化系統癌變；亞硝酸鹽也可以通過胎盤進入胎兒體內，引起胎兒畸變。因此,硝酸鹽和亞硝酸鹽含量是評價蔬菜品質的重要指標之一。
選擇以黃瓜為例的瓜類、以白菜為例的綠葉類、以茄子為例的茄果類蔬菜作為試材。
亞硝酸鹽含量測定
一、溶液配製（GB5009.33-2010）
1、飽和硼砂溶液（50g/L）：稱取5.0g硼酸鈉(Na2B07·10H2O)，溶於100mL熱水中，冷卻後備用。
2、亞鐵氰化鉀溶液（106g/L）：稱取106.0g亞鐵氰化鉀[K4Fe9(CN)5·3H2O]，用水溶解，並稀釋至1000mL。
3、乙酸鋅溶液（220g/L）：稱220g乙酸鋅[Zn(CH2C00)2·2H2O]，先加30mL冰乙酸溶解，用水稀釋至1000mL。
4、對氨基苯磺酸溶液（4g/L）：稱0.4g對氨基苯磺酸，溶於100mL20%（V/V）鹽酸中，混勻後，至棕色瓶中，避光保存。
5、N-(1-萘基)-乙二胺鹽酸鹽溶液(2g/L):稱取0.2gN-(1-萘基)-乙二胺鹽酸鹽，溶入少量水中後全部轉移至100mL容量瓶中，加水至標線，混勻。置於棕色瓶避光保存。
6、亞硝酸鈉標準溶液（100g/L）:準確稱取0.1000g於矽膠乾燥器中乾燥24h的亞硝酸鈉，加水移入1000mL容量瓶，加水稀釋至刻度，混勻。
7、亞硝酸鈉標準溶液（10g/L）：臨用前，吸取10mL亞硝酸鹽標準溶液，置於100mL容量瓶，加水稀釋至刻度。
所用試劑未註明均為分析純，實驗用水均為去離子水。所有實驗用的玻璃儀器均用去離子水冼滌使其徹底乾淨，以確保無外來硝酸根離子(NO3-)和亞硝酸根離子(NO2-)的幹擾。
二、標準曲線
採用國家標準（GB5009.33-2010）鹽酸萘乙二胺法。配製一系列各濃度的亞硝酸鹽溶液：取10ug/mL亞硝酸鈉標準使用液0.00mL、0.10mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.60mL、2.00mL，分別置於50mL帶塞比色管中。於標準管中分別加入2mL對氨基苯磺酸溶液，混勻，放置3-5min，加入1mL鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置15min，用2cm比色皿，以零管調節零點，于波長538nm處測吸光度，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪製亞硝酸鹽的標準曲線。
根據標準曲線，採用下式計算亞硝酸鹽含量，亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計）：
式中：
X1——樣品中亞硝酸鹽的含量（mg/kg）；
M——樣品質量（g）；
A1——測定用樣液中亞硝酸鹽的質量（μg）；
V0——樣品處理液總體積（mL）；
V1——測定取樣液體積（mL）。
三、回收率的測定
參考馬巍（1999）[8]方法，採用加外標回收率的方式驗證樣品消解損失程度和方法的準確度。
四、精密度測定
配製10ug/mL亞硝酸鹽標準溶液，移取0.8mL的該標準溶液於50mL比色管內，按照重氮化偶合法在538nm處重複測定標樣7次，計算吸光度的平均值和標準平均偏差。
五、數據處理
對試驗試數據採用Excel及SPSS 13.0統計軟體處理。
結果與分析
一、標準曲線製作
由標準曲線（見圖1）可知，標準工作曲線線性良好，不同濃度的亞硝酸鹽在538nm處的吸光度是呈線性規律，其回歸方程為y=0.6489x+0.0023，線性相關係數R=0.9997，相對係數在0.9995以上。
二、樣品前處理條件確定
1、提取溫度和水浴時間對亞硝酸鹽檢測結果的影響
不同提取溫度和水浴時間對亞硝酸鹽的影響檢測結果見圖2。
由圖2可以看出，不同溫度下溶液對亞硝酸鹽的溶解量及提取速度存在差異，100℃時，水浴時間45min提取的亞硝酸鹽含量最高；70℃時，水浴時間45min提取的亞硝酸鹽含量最高，但兩種溫度相比70℃水浴下提取的亞硝酸鹽含量更為高，因此提取亞硝酸鹽的最佳水浴條件是70℃的水浴45min。
2、不同顯色時間對亞硝酸鹽檢測結果的影響
不同顯色時間對亞硝酸鹽檢測結果的影響測定結果（見圖3）顯色15min時，亞硝酸鹽含量檢出率最高，之後隨著顯色時間的延長，亞硝酸鹽的吸光度變小，35min後雖稍有上升，但幅度不大。亞硝酸鹽和顯色劑反應可生成絡合物，顯色15min時，其吸光度最大。故宜選擇15min作為顯色時間。
3、活性炭對亞硝酸鹽測定結果的影響
活性炭對亞硝酸鹽含量的測定結果（見圖4）可以看出，加入活性炭的試驗組樣品中亞硝酸鹽檢出值為3.50mg/kg，無活性炭的試驗組樣品亞硝酸鹽檢出值為1.00mg/kg，二者差異極顯著。活性炭可消除抗壞血酸對亞硝酸鹽測定的幹擾，使得亞硝酸鹽檢出值更為準確。因此，宜選擇加入活性炭處理，以提高檢出率。
三、方法驗證
樣品亞硝酸鹽回收率試驗測定結果（見表1）表明，3個樣品的亞硝酸鹽回收率分別為91.11%、91.00%、102.00%，平均回收率為94.63%，相對平均偏差為5.1%。檢出限數值越低，儀器和方法的靈敏度越高；內標回收率越高，儀器的準確度和精密度越高；外標回收率越高，消解損失程度越低，方法準確度越高。在運用分光光度法對樣品進行測定時，通常需要測出所用方法的待測元素的回收率，以此評價方法的準確度和可靠性，回收率越接近1，則方法的可靠性越高。
由精密度試驗測定結果（見表2）可見，通過重複測定標樣七次和計算吸光度的重複性，亞硝酸鹽的相對標準偏差為0.29%，小於2%，表明完全可滿足試驗精密度要求。
採用國標（GB5009.33-2010）鹽酸萘乙二胺法測定蔬菜中亞硝酸鹽，樣品前處理的最佳條件是在70℃水浴45min，顯色15min，加入活性炭進行消除抗壞血酸處理，平均回收率可達到94.63%，亞硝酸鹽的相對標準偏差為0.29%，相對平均偏差為5.1%。
（作者單位：甘肅省產品質量監督檢驗中心）