新藥研究中穩定性指示的分析方法開發與驗證概要

內容來源：藥事縱橫

引 言

在新藥研發的Non-Clinical階段，為什麼要開發具有穩定性指示作用的方法？

Non-Clinical階段的降解試驗與後階段有何不同？需要考慮哪些注意事項？

方法驗證中的疑難問題是否已困擾你很久？找到答案了嗎？

本文由默克、禮來等著名公司專家及高校專家撰寫，將引領你和團隊從多維度思考問題並獲得答案。

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藥物非臨床研究與穩定性指示方法

非臨床研究製劑（也稱為臨床前或非GLP製劑）在藥物的早期開發中起著關鍵作用。這種製劑能夠把藥物（原料藥）帶入到試驗動物中進行藥動學和毒理學研究。由於這些研究最終會用於支持人的劑量和安全性，因此對了解藥物的濃度、PK/PD、工藝雜質和降解雜質的安全性數據是很重要的。因此，業內人士已開展對能夠準確檢測和定量藥物活性成分、雜質、降解雜質的方法進行開發和驗證。這種方法往往能夠提供穩定性的趨勢性結果，因此稱為穩定性指示方法。本文對非臨床研究製劑穩定性指示方法的開發和驗證進行了綜述，為從事相關研究的團隊提供指導。

藥物開發根據需要包括許多階段。儘管非臨床階段並不需要分析降解產物，但是很多公司還是要更多了解活性成分，如，在這個階段研究降解產物。此階段獲得的毒理學數據能了解藥物、雜質及降解產物的安全性，因此後續階段中會出現哪些雜質、每個雜質有多少量是很重要的。目前的指導原則強調後期的驗證，沒有在非臨床階段涉及穩定性指示方法。本文綜述了幾種方法來進行穩定性指示方法的開發和驗證，對降解產物進行定量測定。這些建議不是技術上必須遵循的規定，而是為那些想把這種方法引入到非臨床研究中的人員提供基本思路。本文重點關注小分子藥物非臨床製劑雜質和降解產物的分析方法開發和驗證。

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穩定性指示方法開發和驗證中的重要問題分析

研究中使用的所有分析方法都應該是符合其使用目的，能夠獲得可靠結果並沒有顯著偏差的。這些非臨床研究中的分析方法主要在於提供微量雜質和降解產物的定量結果。用於穩定性指示方法的開發與驗證應基於此目的進行設計，保證具有足夠的選擇性、靈敏度。有幾個重要的部分需要考慮：

（1）降解試驗

在非臨床研究中，如果有足夠的時間和樣品，在穩定性指示方法的開發中應考慮進行降解試驗研究。通常，在這個階段，藥物的工藝雜質已經確定，強制降解研究可以為藥物由於化學或者物理不穩定性結果提供一個多維度的分析。方法開發中的降解試驗應對潛在的氧化、光照、水解雜質具有選擇性。需要注意的是降解試驗中產生的降解物在正常貯藏條件也可能或不可能產生。如果降解產物可能引起安全性或毒性問題，在臨床前研究中應進行必要研究。

所有的降解試驗可以使用活性成分預期濃度的儲備液進行。實驗應在活性成分的預期劑量濃度下用原液進行，可以採用確定處方進行配製，如果處方沒有最終確定，可採用溶液進行。

考慮降解條件，儲備液可以採用乙腈-水和甲醇-水作為溶劑配製，推薦配製質控樣品。所有的降解產物的UV光譜應採用PDA檢測器測定。如果沒有PDA檢測器，UV/Vis檢測器應使用210-220nm的檢測波長，但是此時，是無法獲得峰純度數據的。UV光譜應與活性成分進行比較，以確定雜質、降解產物的相對響應是否與主峰一致。例如如果方法的檢測波長為235nm，降解產物在這個波長下沒有吸收，那麼這個雜質就不會獲得質量平衡。任何降解試驗應在短期或者不苛刻的條件下進行。

主要降解途徑的敏感性可以通過觀察活性成分的降解程度來獲得。如果出現10%或更少，說明在臨床前製劑中出現的可能性小，如果藥物損失較大，說明在臨床前製劑中出現潛在降解產物的可能性大，應該在方法驗證中對降解產物進行分離度和定量考察。確定關鍵的降解途徑有助於對臨床前處方和貯藏條件進行確定。以下為幾個常見的降解試驗設計：

自由基氧化可以使用偶氮二異丁腈（Azobisisobutyronitrile，AIBN）來進行研究。取約10mg的AIBN，加入到盛有10ml儲備液的20ml量瓶中，在40℃下反應1-3天。

親核氧化反應可以通過在儲備液中或處方中加入稀過氧化氫溶液，在室溫下反應24h進行。可能產生N-氧化物或亞碸雜質。

酸水解可以通過在儲備液中或處方中加入稀鹽酸溶液進行。降解溶液可以在室溫或60℃條件下放置3天。同理，鹼水解可以通過稀氫氧化鈉溶液以相同方式獲得。二者可採用相應的酸鹼稀溶液進行中和。

光降解試驗可以採用乙腈/水或甲醇/水儲備液或計劃處方，在ICH規定光照箱中進行10w/m2的20h試驗。

熱降解試驗可以採用儲備液在高溫下進行，典型條件是在60°C 進行24–48 h, 基於貯藏條件，其他室溫以上的條件也可以採用。

質量平衡應進行考慮，有很多因素會導致質量不平衡，如：降解產物沒有發射團、在死體積時洗脫下來、極性太大、或由於疏水性強，特別是如果形成了二聚體或加合物，而沒有在梯度條件下被洗脫下來。

對於非臨床分析，通常認為所有的雜質具有相同的響應因子，如果在檢測波長下降解產物的響應因子與火活性成分差異較大（超過20%），可能就不會獲得質量平衡。如果由於上述原因沒有獲得質量平衡，結果應進行記錄，並在後續開發階段進行進一步研究。

（2）降解試驗的問題解答

與任何方法開發項目一樣，實際發生的事情往往與計劃不同。以下是一些處理問題的方法。

助溶劑：當採用乙腈作為助溶劑時，有可能形成甲酸。甲酸與仲胺在溶液中會形成加合物。在這種情況下，當進行水解研究時，可以考慮使用其他溶劑，如DMSO。

pH值：當使用極端pH值進行降解研究時，如果採用HPLC/UV檢測或發現峰形較差時，要使注入HPLC的溶液的pH值與流動相的pH值接近。建議流動相或緩衝溶應具有更強的離子強度來控制溶液的pH值，以使峰形不受影響。強烈建議在HPLC之前檢查樣品溶液的pH值，一般pH值範圍為2-8對大部分色譜柱是可以接受的，但是應關注廠家的推薦範圍。

混懸液：對於懸浮液製劑樣品，在進行任何分析前必須保證均勻性。通常包括將樣品進行渦旋或強力混合，確保代表性。如果溶液不均一，將會導致雜質和降解產物含量測定結果不準確。

雜質水平：注入HPLC的API濃度應足夠高，確保所有相關雜質/降解產物峰能夠出峰並定量。雜質/降解產物峰沒有彼此分開的，可以通過調整流動相組成、pH、柱溫、柱長、梯度斜率進行調節。

色譜方法：梯度洗脫優於等度，應以高比例水相開始，以高有機相比例結束。注意不要使緩衝液在高比例有機相中出現渾濁。採用UV檢測時，推薦使用儘可能低的波長確保雜質/降解產物峰能夠被檢測到。採用API的最大吸收波長可能不會檢測到在這個波長下沒有的降解產物峰。採用PDA檢測器可以檢測峰純度和光譜圖來增加專屬性。推薦使用15cm或以上柱長、≥5 m粒徑的色譜柱來增加HPLC分離度。對於UPLC，應使用短的、細粒徑的色譜柱。色譜柱填料應確保對pH和高比例水溶液耐用。C18為常用的色譜柱填料，色譜分離的目標是通過使用恰當的固定相使雜質/降解產物峰分離，色譜柱的選擇對於成功進行方法開發和驗證至關重要。

需要注意的事情如下：

與玻璃或塑料非特異性吸附

峰寬/峰形差是由於注入溶液的強度大於流動相

不可接受的前沿/拖尾峰是由於pH不兼容

降解試驗中降解產物間的分離度差

降解產物或活性物質沒有充分保留

所有樣品在分析前應進行充分混合保證均一性

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方法驗證推薦方法

方法驗證的目的是通過定性和定量數據證明非臨床製劑測試結果可靠和準確。穩定性指示方法的靈敏度和專屬性對於測定微量雜質和降解產物來說非常重要。驗證參數和可接受範圍應基於使用目的來確定，需要一定的準確度和精密度。每一個參數和可接受範圍在方法驗證方案中進行設置。方法要能夠區分活性成分、已知降解產物及處方中的其他組分或與API相關的成分（如殘留起始原料、中間體、副產物、輔料等）並能夠保證結果準確可靠。

方法被驗證後，對方法的任何更改都將需要進行部分驗證。部分驗證通常包括對方法中任何參數的評估。此外，如果驗證的方法被轉移到另一個實驗室，則要起草方法轉移方案。

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方法驗證參數

（1）專屬性/選擇性

專屬性/選擇性是指方法區分API和其他成分的能力。其他成分包括輔料、容器的溶出物、殘留溶劑、測試物相關的雜質或降解產物。專屬性/選擇性應通過那些潛在幹擾成分與活性成分的幹擾情況（如輔料、空白溶劑）以及降解試驗進行評價。色譜法中，其他峰應與主峰分離，保證所積分的色譜峰的準確性和重複性。此外，對於降解樣品，應採用PDA或MS對活性成分進行峰純度評價，並與新配製的溶液進行比較，確保沒有與主峰共洗脫出色譜峰。已知雜質或降解產物應加入到新配製的含活性成分的溶液中，確保與被測定峰完全分離。

（2）準確度

準確度表示測量結果與理論結果的接近程度。如可能，可把降解雜質以活性成分的不同水平加入到樣品中。如果不能獲得，降解樣品可以用來測定方法的準確度。準確度採用待測物的回收率百分比、相對誤差或者與理論值的偏差來表示。方法的準確度與方法的使用目的有關。

（3）精密度

精密度表示在相同儀器條件下待測成分每個測定結果的接近程度。低含量雜質的精密度應採用絕對差而不是%RSD或%CV表示，因為二者會受到低含量雜質的負面影響。精密度應採用至少三份（推薦5-6份）樣品進行評價。

（4）線性與範圍

方法的線性範圍應包括在整個分析濃度範圍。穩定性指示方法的檢測能力很關鍵。分析物濃度與檢測器響應值進行線性回歸，當相關係數≥0.99時線性關係良好。因為在早期開發階段單獨分離的雜質單體可能沒有獲得，因此，每個雜質對主峰的相對響應因子（RRF）在非臨床階段被認為是1。在開發後期，這些值應通過實驗進行測定。

（5）檢測限與定量限

檢測限（LOD）是分析物與空白樣品背景響應比的最低分析濃度，通常為空白樣品響應值的3-5倍。定量限（LOQ）是具有一定準確度與精密度的最低檢測濃度。二者可通過不同方法進行測定。無論使用哪種方法，在記錄中應進行清晰準確的記錄所採用的方法。通常，所採用的方法基於分析物的可獲得性。LOD有時不用測定，除非這個雜質或降解產物是感興趣的成分或者其濃度低於LOQ，這種情況下獲得LOD數據可以有助於評估分析物的濃度。

（6）耐用性

耐用性通過方法參數的微小改變進行評估。包括流速、流動相組成、pH、柱溫、不同使用時間色譜柱、不同批號色譜柱、不同人員等。這些變化可以通過以下參數進行評估：拖尾因子、分離度、理論板數、準確度、精密度、LOD或LOQ。

（7）穩定性

樣品在儲存、製備和分析中的穩定性應進行評估。包括API的穩定性、製劑的穩定性、過程處方的穩定性、凍-融的穩定性、活性儲備液的穩定性。每個溶液應該採用恰當的儲藏條件（如室溫、冰箱、冷凍等）考察一定時間來評估穩定性。降解產物的雜質定量分析方法考察每個雜質量。因此，這些方法提供了強大的預測能力。下面介紹了這些方法所涉及的幾個實驗設計。

原料穩定性

通常，原料藥對照品應在低於原料藥規定的長期條件下貯藏。例如，如果原料藥規定在冰箱內貯藏，那麼對照品會在冷凍下貯藏。原料藥的穩定性通過與對照品的比較進行分析，並對增加的降解產物進行定量分析。通常需要在擬定的時間間隔點測定。

製劑穩定性

製劑穩定性是為了保證在使用期間的穩定性。通過與新製備的對照溶液進行比較來測定。了解製劑的雜質譜和降解程度有助於對每個雜質進行毒理學鑑定。

使用過程穩定性

樣品可能由於儀器故障或斷電重新進樣，這時應考察使用過程中的穩定性，例如在存放條件（如在自動進樣器中）下進行考察。通常需要在樣品的存放條件下進行2-3天考察。

凍-融試驗

根據預期貯藏條件和樣品分析方法，有必要評價凍-融穩定性。如果進行評價，應包括樣品凍融的次數和條件。應將凍和融樣品與新配製的相同濃度的活性成分對照溶液進行比較。

貯備液

活性成分貯備液的穩定性應在預期貯藏條件和貯藏時間內（如6h）進行評估。評估時應將貯備液的響應值與新配製的溶液進行比較。

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總結

了解新藥及其雜質的毒性在臨床前研究中是重要的一部分內容。非臨床研究中雜質的分析方法應進行恰當的開發和驗證，包括準確度、精密度、線性、範圍、選擇性、靈敏度、耐用性，要符合FDA相關指導原則規定。這些方法有助於在非臨床研究前以及非臨床研究中對製劑進行穩定性和純度的評價。按照本文推薦方法將確保所用的分析方法耐用、可靠。