凝膠層析的原理、特點及分類簡析

凝膠層析（gel chromatography），又稱為，凝膠過濾、分子篩層析、排阻層析、凝膠滲透層析等。

凝膠層析法適用於分離和提純蛋白質、酶、多肽、激素、多糖、核酸類等物質。分子大小彼此相差25%的樣品，只要通過單一凝膠床就可以完全將它們分開。利用凝膠的分子篩特性，可對這些物質的溶液進行脫鹽、濃縮、去熱源和脫色。下面就有關凝膠層析的原理和特點做簡要介紹。

凝膠是一類多孔性高分子聚合物，每個顆粒猶如一個篩子。當樣品溶液通過凝膠柱時，相對分子質量較大的物質由於直徑大於凝膠網孔而只能沿著凝膠顆粒間的空隙，隨著溶劑流動，因此流程較短，向前移動速度快而首先流出層析柱；反之，相對分子質量較小的物質由於直徑小於凝膠網孔，可自由地進出凝膠顆粒的網孔，在向下移動過程中，它們從凝膠內擴散到膠粒孔隙後再進入另一凝膠顆粒，如此不斷地進入與逸出，使流量增長，移動速率慢而最後流出層析柱。而中等大小的分子，它們也能在凝膠顆粒內外分布，部分進入顆粒，從而在大分子物質與小分子物質之間被洗脫。這樣，經過層析柱，使混合物中的各物質按其分子大小不同而被分離。過程如下圖。

凝膠層析法常用的凝膠有天然凝膠（如瓊脂粉凝膠）和人工合成凝膠（如葡聚糖凝膠和聚丙烯醯胺凝膠）。

1）葡聚糖凝膠

葡聚糖凝膠（Sephadex）具有良好的化學穩定性，是目前生化產品製備中最常用的凝膠。

葡聚糖凝膠網孔大小可通過調節交聯劑和葡聚糖的配比及反應條件來控制。交聯度越大，網孔越小，吸水膨脹就越小。交聯度越小，網孔越大，吸水膨脹就越大。

G類葡聚糖凝膠（Sephadex-G）的最基本骨架是葡聚糖，它是一種以右旋葡萄糖為殘基的多糖，分子間主要是α-1,6-糖苷鍵（約佔95%），分支為1,3-糖苷鍵（約佔5%），以1-氯-2,3-環氧丙烷為交聯劑將鏈狀結構連接為三維空間的網狀結構的高分子化合物。

G類葡聚糖凝膠常用G-X代表，X數字既代表交聯度，也代表持水量（吸水量）。X數字越小，交聯度越大，網孔越小，適用於分離低分子質量生化產品。X數字越大，交聯度越小，網孔越大，適用於分離高分子生化產品。X數字也代表凝膠的持水量，如G-25表示1g幹膠持水2.5ml，G-100表示1g幹膠持水10ml，依此類推。

2）聚丙烯醯胺凝膠

聚丙烯醯胺凝膠也是一種人工合成凝膠，其商品名為生物凝膠P（Bio-gel-P），和交聯葡聚糖一樣，為顆粒狀乾粉，在溶劑中能自動吸水溶脹成凝膠。其由單體丙烯醯胺和交聯劑甲叉雙丙烯醯胺通過自由基引發聚合形成聚丙烯醯胺凝膠。只要控制單體用量和交聯劑的比例，就能得到不同型號的凝膠。

在聚丙烯醯胺凝膠的合成過程中，單體和交聯劑的配比可以任意改變。以（T）代表100ml凝膠溶液中含有的單體和交聯劑總克數，稱為凝膠濃度。而其中交聯劑佔單體和交聯劑總量的百分比稱為交聯度，以（C）表示，交聯度越大，網孔越小，交聯度越小，則網孔越大。聚丙烯醯胺凝膠全是由碳-碳骨架構成，穩定性較好，適合於做凝膠層析的載體。只有在極端pH條件下醯胺鍵才能被水解為羧基，使凝膠帶有一定的離子交換基團，故一般只在pH2-11的範圍內使用。

根據聚丙烯醯胺凝膠的溶脹性質和分離範圍的不同，可分成10種類型。各種類型均以英文字母P和阿拉伯數字表示，從Bio-Gel P-2至Bio-Gel P-300。P後面的阿拉伯數字乘以1000即相當於排阻限度（按球蛋白或肽計算）。

3）瓊脂糖凝膠

瓊脂糖凝膠（agarose gel）可以分離葡聚糖凝膠和生物膠所不能分離的大分子，使凝膠層析的分離區間擴大到大分子和病毒顆粒，其最大範圍可達相對分子質量108 ，但是由於瓊脂有強烈的吸附作用，給使用造成了困難，後來，從瓊脂中分離出兩個組分，一個組分為帶負電荷的瓊脂果膠，含有磺酸基和羧基；另一組分叫瓊脂糖，它不含有帶電基團，其結構是由β-D-吡喃半乳糖和3,6脫水-L-吡喃半乳糖相結合的鏈狀多糖。這種瓊脂糖被用來進行凝膠層析，它既具有瓊脂凝膠相同的分離區間，又沒有吸附作用。但其穩定性遠不如葡聚糖凝膠和生物膠P，強酸強鹼能引起結構破壞。最好使用條件控制在pH 4-9之間，溫度0-40℃，超出此範圍，可能被破壞。

瓊脂糖凝膠做成珠狀後不再脫水乾燥，否則不能再溶脹恢復原有現狀，因此商品大都以含水狀態供應，並應在溼態保存。一般懸浮在10-3 mol/L EDTA和0.02%疊氮化鈉溶液中。百分數表示幹膠量。

對生物樣品來說，經常遇到的是兩種分離形式。一種是只將分子量極為懸殊的兩類物質分開，如蛋白質與鹽類，稱作類分離或組分離。另一類則是要將分子量相差不很大的大分子物質加以分離，如分離血清球蛋白與白蛋白，這叫做分級分離。後者對實驗條件和操作要求都比較高。

1）類分離

目的是分開樣品中分子量懸殊的「較大分子組」和「較小分子組」兩類物質，並不要求分離分子量相近的組分。

選擇凝膠時，應使樣品中大分子組的分子量大於其排阻限，而小分子組的分子量小於滲入限。這樣能取得最好的分離效果。例如從蛋白質溶液中除去無機鹽。蛋白質的分子量都大於5000D，而無機鹽的分子量一般在幾十到幾百之間。所以常選用Sephadex G-25凝膠作為分離固定相，因為它的分離範圍是1000-5000D。被分離的兩組物質的分子量正好落在分離範圍的兩側。大分子組為全排阻，而小分子組為全滲入。對於分子量小於5000D的肽類進行脫鹽操作則常選用Sephadex G-15凝膠。

2）分級分離

目的是分開分子量不是很懸殊的大分子物質。選擇凝膠型號時必須使各種物質的Kd（分離係數）值儘可能相差大一些。為此，首先決不能使它們的分子量都分布在凝膠分離範圍的一側，也就是Kd不要都接近於0或1，而要使組分的分子量儘可能分布在凝膠分離範圍的兩側，或接近兩側的位置。如果樣品中含有3個組分的話，最好一個接近全排阻，另一個接近全滲入，第三個為部分滲入，且分子量大於滲入限的3倍，並小於排阻限的1/3。因為分子量如與滲入限比較靠近，該組分分子在凝膠顆粒中運動所受的約束很小，不易與低分子組分分開。如分子量與排阻限比較靠近則不易與高分子組分分開。

1）凝膠層析操作簡便，所需設備簡單。有時只要有一根層析柱便可進行工作。分離介質——凝膠完全不需要像離子交換劑那樣複雜的再生過程便可重複使用。

2）分離效果較好，重複性高。最突出的是樣品回收率高，接近100%。

3）分離條件緩和。凝膠骨架親水，分離過程又不涉及化學鍵的變化，所以對分離物的活性沒有不良影響。

4）應用廣泛。適用於各種生化物質，如肽類、激素、蛋白質、多糖、核酸的分離純化、脫鹽、濃縮以及分析測定等。分離的分子量範圍也很寬，如Sephadex G類為102-105 D；Sepharose類為105-108 D。

5）解析度不高，分離操作較慢。由於凝膠層析是以物質分子量的不同作為分離依據的，分子量的差異僅表現在流速的差異上，所以分離時流速必須嚴格把握。因而分離操作一般較慢。而且對於分子量相差不多的物質難以達到很好的分離。此外，凝膠層析要求樣品粘度不宜太高。凝膠顆粒有時還有非特異吸附現象。