Science|識別基因功能的新技術Perturb-Seq並揭示自閉症風險基因

導讀

頂級期刊《Science》發布張峰等團隊的最新研究進展，他們開發一種新的體內大規模遺傳功能研究技術Perturb-Seq，可同時研究生物體內不同細胞類型中不同基因的功能，並篩選了幾十個與自閉症相關的基因，揭示了相關的神經元和膠質細胞異常。

自閉症與基因

研究背景

人類遺傳學研究發現了成千上萬個基因的遺傳變異與複雜人類疾病之間的關聯，尤其是全外顯子測序（Whole-exome Sequencing, WES）揭示了與神經系統疾病有關的功能缺失變異，如自閉症譜系障礙和神經發育延遲（Autism Spectrum Disorders and Neurodevelopmental disorder, ASD/ND）。與全基因組關聯研究（Genome-wide Association Studies, GWASs）確定的常見變異相比，此類變異具有較大的效應量、高滲透性，且發生在基因編碼區內，因此對疾病建模和機制研究有非常用藥的參考價值。

然而，確定相關風險基因中每個位點的作用是主要的挑戰。例如，ASD/ND包含了廣泛的具有高度異質遺傳引起的神經發育障礙，包括數百個高滲透性的從頭風險新變異基因。此外，這些基因編碼的基因產物的功能各異，很難排除對潛在的神經元類型、發育過程或神經發育過程中受影響的分子或基因的先驗預測。由於這些風險基因很少在動物實驗中研究，因此它們在大腦發育過程中的功能及作用了解甚少。由於生成和分析單個基因敲除動物模型畸形功能研究耗時長難度大，因此開發可擴展的、通用的、高解析度的、高含量的表型分型方法來識別和鑑定體內遺傳擾動對不同功能的組織或細胞的影響非常重要。

Perturb-Seq技術揭示自閉症相關基因

來自美國哈佛大學和麻省理工學院的張峰、Aviv Regev和Paola Arlotta團隊合作，於2020年11月27日在頂級期刊《Science》發表了題為「In vivo Perturb-Seq reveals neuronal and glial abnormalities associated with autism risk genes」的研究長文，作者應用了一種可擴展的遺傳篩選方法，在體Perturb-seq，在功能上評估了35個ASD/ND的de novo喪失功能的風險基因。他們使用CRISPR-Cas9技術，在孕期小鼠子宮內的小鼠大腦風險基因中引入移植編碼，然後對出生後大腦中受擾動的細胞進行單細胞RNA測序。作者從神經元和神經膠質細胞中鑑定出細胞類型特異性和進化上保守的基因模塊。結果表明，複雜的基因模塊和細胞類型在整個擾動中都受到影響，代表了ASD/ND風險基因模塊的關鍵細胞效應。

該研究在Science雜誌上的online信息

在體Perturb-Seq技術評估ASD/ND風險基因的功能

作者從最近發表的一項包含4634例的ASD/ND原發患者的WES研究中選擇了ASD/ND候選基因，並對35個候選基因對ASD/ND的識別性進行了優先排序，原則上這些基因可在多種細胞類型和發育階段起重要作用。

CRISPR-Cas9技術

為了探究不同基因在ASD/ND中的作用，作者採用CRISPR-Cass9介導的基因組編輯方法優化的在體Perturb-Seq技術，將每個風險基因的突變引入孕期小鼠子宮發育中小鼠大腦的祖細胞中，然後在小鼠出生後第7天進行scRNA-Seq。

圖1 在體Perturb-Seq平臺示意圖

免疫組織化學分析和出生後第7天的BFP陽性神經元的scRNA-seq結果都表明，Perturb-Seq載體在大腦皮層中的多種神經元和神經膠質細胞類型都有穩定表達，如星形膠質細胞、抑制性神經元、興奮性神經元、小膠質細胞和少突膠質細胞 。

圖2 Perturb-Seq有效性證據

在體Perturb-Seq的特異性靶向作用，但不影響總體細胞類型組成

作者通過對18個不同的孕期小鼠隊列研究表明，藉助於螢光激活細胞分選技術（FACS）富集了受擾動的神經元，並與基因座中的內源性GFP陰性對照構建體對比。作者使用LOUVAIN聚類將細胞劃分為主要的細胞類型並通過已知的標記基因表達進行標註，重點關注了5個主要細胞類型的ASD/ND基因表達情況。對對照組相比，ASD/ND風險基因的擾動效應對這5種主要細胞類型的影響比較小。

圖3 Perturb-Seq對五種細胞類型的影響

ASD/ND基因擾動影響多種細胞類型的細胞狀態

為了評估ASD/ND遺傳擾動是否引起細胞狀態的分子變化，作者首先定義了5中廣泛的細胞類型中的都有變異的基因模塊。作者首先計算每個細胞的基因表達分析得分並將線性回歸模型擬合，來測試已知基因本體論基因集的表達是否收到影響。作者使用加權基因相關網絡分析（WGCNA）和結構主體模式（STM）這兩種方法重新確定基因模塊，通過降低維度來識別具有相關表達基因集，然後評估每個擾動組細胞中的模塊基因表達情況並計算其擾動效應。

圖4 Perturb-Seq證實ASD/ND風險基因擾

ASD/ND風險基因Chd8和Gatad2b改變少突膠質細胞的基因模塊

研究人員證實，在Perturb-Seq實驗中，Chd8和Gatad2b擾動顯著降低了少突膠質細胞中ODC1模塊的表達。ODC1模塊在少突膠質細胞前體細胞中高表達，而在定性少突膠質細胞祖細胞和新生的少突膠質細胞中低表達，表明該基因模塊與少突膠質細胞的成熟有關。因此，Chd8和Gatad2b基因的擾動會改變少突膠質細胞的成熟。

圖5 Chd8和Gatad2b基因對少突膠質細胞

Perturb-Seq結果與自閉症患者腦組織中的表達變化相關

研究人員接下來探究了在小鼠Perturb-Seq中的實驗結果能否與自閉症患者死亡後大腦中觀察到的變化相似。作者通過將實驗數據與自閉症大腦中snRNA-seq數據集進行比較，並使用DESeq2進行統計上保守的偽大體分析，定義了每種細胞類型中的差異表達基因，並校正了年齡、性別和患者之間的差異。結果表明，在抑制性神經元、興奮性神經元或少突膠質細胞等3種主要細胞類型中，自閉症患者中35個ASD/ND相關基因的數據結果與小鼠Perturb-Seq數據保持一致。

圖6 Perturb-Seq細胞類型特異性基因在

研究意義

在體Perturb-Seq技術可以用作大型基因組的系統遺傳研究的可擴展工具，已在複雜組織中以單細胞解析度水平上揭示細胞內在的功能。本文證實了Perturb-Seq在大腦發育過程中ASD/ND風險基因的研究與應用，未來也可用於多種疾病和組織。此外，在體Perturb-Seq技術發現了異質遺傳病理學受影響的途徑和細胞類型，指導下遊研究，並未我們從遺傳變體向功能性遺傳體模型的完善提供了重要方法和信息。

參考資料

Jin, X., et al., In vivo Perturb-Seq reveals neuronal and glial abnormalities associated with autism risk genes. Science, 2020. 370(6520).

DOI: 10.1126/science.aaz6063