體內Perturb-Seq技術與自閉症風險基因相關神經元和神經膠質異常

解讀 | 章臺柳

責編 | 酶美

人類遺傳學研究發現複雜的人體疾病和數千個基因位點的遺傳變異具有相關性。而全外顯子測序（WES）分析揭示出大量與神經發育疾病風險相關的新的功能喪失變異，包括自閉症和神經發育遲緩（ASD/ND）【1】，與全基因組關聯研究（GWAS）確定的常見變異相比，這種新發現的風險變異通常具有較大的效應效能、較強的滲透性，並且發生在基因編碼區域，因此為疾病建模和機理研究提供了非常關鍵的切入點。

然而，研究的難點在於如何確定這些風險基因中每一個基因的作用。例如，ASD/ND是由大量具有高度異質性基因貢獻的神經發育障礙，包括數百個高度滲透的新發風險變異基因【2】。這些基因編碼的蛋白在功能上具有多樣性，很難對其發揮作用的潛在腦細胞類型、發育過程和神經發育過程中分子途徑進行預測【3】。這些風險基因中很少有在動物或細胞模型中被研究，因此它們在腦發育過程中的作用尚不清楚。構建單個基因敲除動物來進行功能研究，需要耗費大量的人力和時間，因此非常需要開發大規模、通用、高解析度的表型分析方法，來鑑定體內遺傳擾動對組織和細胞特異性的影響。

2020年11月27日，來自Broad研究所的Xin Jin、Aviv Regev、張峰和Paola Arlotta在Science雜誌發表文章In vivo Perturb-Seq reveals neuronal and glial abnormalities associated with autism risk genes，研發出一種體內大規模遺傳功能研究技術Perturb-seq：首先利用CRISPR-Cas9在35個ASD/ND新發風險基因中引入移碼突變，隨後轉染進子宮內發育的小鼠大腦中，然後對出生後大腦中受到幹擾的細胞進行單細胞RNA測序。測序分析從神經元和膠質細胞類中鑑定出細胞類型特異和進化保守的基因模塊。這些風險基因的擾動會影響到神經發育過程中反覆出現的基因模塊和細胞類型，證明這些風險基因對關鍵細胞過程的影響。很多基因變異在不同的細胞或組織器官裡往往能有不同的功能，但傳統的bulk analysis往往隱沒了這些基因在少數的細胞的功能。作者建立了活體內的Perturb-seq系統，在一個發育胚胎中引入基因編輯來敲除疾病相關的基因，然後兩周後在發育後的腦細胞裡進行單細胞測序。用這個高通量方法一次性檢測了35個自閉症基因，並且檢測他們在不同的腦細胞態裡的功能。

研究人員從近期發表的WES研究結論中挑選廣泛的神經發育障礙類別中ASD/ND患者特有的新發變異，共38個ASD/ND候選基因（由於分析標準，最終保留下35個）。這些基因具有在人腦組織表達、在多種類型細胞表達等特點，需要規模化的方法去研究其在不同細胞類型和發育事件中的基因功能。研究人員開發出in vivo Perturb-Seq的技術。具體地說，首先使用一個組成性表達Cas9的轉基因小鼠，通過慢病毒感染將針對不同風險基因的gRNAs輸送到子宮內發育不全的胚胎側腦室。每個慢病毒載體包含靶向一個ASD/ND風險基因的5『編碼外顯子的兩個不同的gRNAs（提高敲除效率）和一個BFP報告蛋白-條形碼。隨後在小鼠出生後7天（P7）分選BFP+細胞進行單細胞RNA-seq，通過條形碼識別受幹擾的細胞及對應的風險基因，同時分析細胞表達變化。結果顯示Perturb-seq載體在大腦皮層的各種神經元和膠質細胞中都有表達，這便於在不同類型細胞中分析每一個風險基因的功能。

下面的分析中作者又利用Louvain聚類方法定義出5個泛細胞群：皮質投射神經元、皮質抑制神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞和小膠質細胞/巨噬細胞。篩選出攜帶單基因突變的細胞進行下一步分析，大部分ASD/ND風險基因幹擾對這五種主要細胞類型的存在和比例的影響較少，只有Dyrk1a缺失對細胞組成有顯著影響，增加少突膠質細胞的比例，減少小膠質細胞和巨噬細胞的比例。對五大類細胞中共有的基因模塊進行定義，發現ASD/ND風險基因幹擾對現有的GO類型並沒有顯著影響。利用加權基因相關網絡分析（WGCNA）和結構主題建模（STM）兩種方法分別在五大類細胞中定義新的基因模塊，篩選出WGCNA定義的14個基因模塊，其與STM中一個或或個主題高度相關。這14個模塊有兩大類：一些反映了常見的生物學過程，存在於多個細胞亞群中；另一些代表了僅存在於某些亞群的細胞類型特異性特徵。計算ASD/ND風險基因擾動對這些基因模塊的影響，發現Adnp、Ank2、Ash1l、Chd8、Gatad2b、Pogz、Scn2a1、Stard9和Upf3b等9個基因的擾動對五種基因模塊有顯著的影響，其中Ank2對Ndnf+中間神經元相關模塊（IN1）的調控在單基因突變/幹擾實驗中所驗證。而Chd8和Gatad2b擾動顯著下調少突膠質細胞的ODC1基因模塊，ODC1基因模塊與少突膠質細胞的成熟有關。構建Cdh8雜合突變小鼠，原位雜交發現出生7天後小鼠的皮質中2個經典的少突膠質細胞前體細胞（OPC）標記物Cspg4和Pdgfra的表達顯著下調；發育後期，OPC細胞數目並沒有變化，但MBP+（髓鞘少突膠質細胞的標記物）細胞顯著增加，即Cdh8擾動加速出生後MBP含量的增加，這與in vivo Perturb-Seq得到的結論類似。

最後，研究人員對現有的人類組織（包含成人大腦皮質、ASD供體皮質和匹配對照組、胎兒人類皮質以及3個月、6個月大的人腦類器官）的scRNA-seq和snRNA-seq數據進行分析，發現14個基因模塊都在人類數據是保守存在的，其中8個模塊顯示出更多的模塊內相關性，而且相關性也隨著人類樣本的年齡而增加。那麼，小鼠Perturb-Seq中觀察到的效應是否與ASD病人死後腦區中變化相似？利用現有的數據集定義出ASD病人中不同類型細胞中差異表達的基因，並且在小鼠中有1:1同源類似物的基因共14個。分析顯示中間神經元的SST和興奮性神經元的NRN1在ASD病人中表達降低，與Perturb-Seq試驗中表達顯著減少相一致。這表明Perturb-Seq實驗可以鑑定出人類ASD病人中存在的基因表達異常。

總的來說，研究開發了體內規模化研究基因功能的新技術in vivo Perturb-Seq，可用於探究在複雜組織中同時研究多種基因在多種細胞類型中的功能，為複雜疾病的研究提供了有力的工具。

原文連結：

https://science.sciencemag.org/cgi/doi/10.1126/science.aaz6063

參考文獻

1. F. K. Satterstrom et al., Novel genes for autism implicate both excitatory and inhibitory cell lineages in risk. Cell180, P568 (2018).

2. J. A. Chen, O. Penagarikano, T. G. Belgard, V. Swarup, D. H. Geschwind, The emerging picture of autism spectrum disorder: Genetics and pathology. Annu. Rev. Pathol.10, 111–144 (2015).

3. C. Mullins, G. Fishell, R. W. Tsien, Unifying views of autism spectrum disorders: A consideration of autoregulatory feedback loops. Neuron 89, 1131–1156 (2016).