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見血清為蘭科植物脈羊耳蘭Liparisnervosa（Thunb.）Lindl 的全草，生長於海拔850-1000m的山坡闊葉林下，分布於江西、湖南、福建、臺灣、廣東、廣西及西南地區，具有涼血止血、清熱解毒的功效，是民間的止血要藥，主治胃熱吐血、肺熱咯血、腸風下血、崩漏、手術止血、創傷出血、瘡瘍腫毒、毒蛇咬傷、跌打損傷等症。中藥見血清的療效確切，在民間藥用歷史悠久，但關於見血清化學成分的研究較少，現有文獻主要報導從中分離得到的生物鹼、有機酸及黃酮等成分，藥效物質基礎尚不明確，這限制其進一步的開發利用。本文報導了見血清乾燥帶根全草95%乙醇提取物的石油醚部位中7種單體化合物的分離純化方法，其中化合物3-7為首次從本屬植物中分離得到，化合物1-7為首次從見血清中分離得到。
1 儀器與材料
AVANCE 600型核磁共振儀（Bruker公司，德國）；HPLC3000型高效液相色譜儀（北京創新通恆科技有限公司）；Trace DSQ II氣相色譜-質譜聯用儀（Thermo公司，美國）；Cosmosil5C18-MS-Ⅱ（10mm×250mm，5μm）半製備色譜柱（NacalaiTesque公司，日本）；Sephadex LH-20色譜柱（ParmaciaBioteck公司）；100-200目柱色譜矽膠（批號：0150026，青島海洋化工廠）；200-300目柱色譜矽膠（批號：0120171，青島海洋化工廠）；矽膠H（批號：0130518，青島海洋化工廠）；GF254薄層色譜板（批號：20140806，青島海洋化工廠）；色譜甲醇（批號：20150422，國藥集團化學試劑有限公司）；萃取、分離純化所用有機試劑（分析純）均為國藥集團化學試劑有限公司產品；提取所用95%乙醇為上海凌峰化學試劑有限公司產品。
見血清藥材採集於重慶市黔江區，經揚州大學生物科學與技術學院淮虎銀教授鑑定為蘭科羊耳蒜屬植物脈羊耳蘭Liparis nervosa的乾燥全草，憑證標本（JXQ 20140205）存放於揚州大學醫學院藥學系標本室。
2 提取分離
見血清乾燥帶根全草10kg，粉碎，在85℃下回流提取4次，每次2h，提取液減壓濃縮回收溶劑，得總浸膏837g。將總浸膏混懸於10倍的蒸餾水中，依次用等體積石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，減壓回收溶劑得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水層。石油醚部位浸膏152g經矽膠柱色譜分離，用石油醚-乙酸乙酯（5∶1→0∶100）梯度洗脫，得到18個部分（Fr.1-18）；Fr.10中析出沉澱，重結晶得化合物7（650mg）；Fr.12經矽膠柱色譜分離，用石油醚-丙酮（10∶1→1∶1）梯度洗脫，得6個餾分（Fr.12-1~Fr.12-6），Fr.12-6經凝膠柱色譜，氯仿-甲醇（2∶1）洗脫，得到5個餾分（Fr.12-6-1~Fr.12-6-5），Fr.12-6-4 再經ODS柱色譜，70%甲醇洗脫，得7個餾分（Fr.12-6-4-1~Fr.12-6-4-7），Fr.12-6-4-5經半製備HPLC分離純化，以78%甲醇為流動性，得化合物6（5mg）；Fr.13經矽膠柱色譜分離，用石油醚-丙酮（6∶1→0∶100）梯度洗脫，得到3個餾分（Fr.13-1~Fr.13-3）；Fr.13-2經製備薄層分離純化，得化合物3（6mg）和化合物4、5的混合物，該混合物再經半製備HPLC分離純化，以63%甲醇洗脫得4（12mg），5（8mg）；Fr.13-3經凝膠柱色譜分離，以氯仿-甲醇（2∶1）洗脫得8個餾分（Fr.13-3-1~Fr.13-3-8），Fr.13-3-8經半製備HPLC純化，以60%甲醇洗脫，得化合物2（3mg）；Fr.16經矽膠柱色譜，以石油醚-丙酮（6∶1→1∶1）梯度洗脫，得10個餾分（Fr.16-1~Fr.16-10），Fr.16-4經凝膠柱色譜分離，氯仿-甲醇（2∶1）洗脫，得7個餾分（Fr.16-4-1~Fr.16-4-7），Fr.16-4-7再經半製備HPLC分離純化，以60%甲醇洗脫，得化合物1（4mg）。
3 結構鑑定
化合物1：棕色無定形粉末，EI-MS ES+：m/z240[M]+。1H-NMR（Acetone-d6，600MHz）：δ9.53（1H，s，5-OH），7.63（1H，d，J=8.4Hz，H-9），7.51（1H，d，J=8.4Hz，H-10），7.43（1H，t，J=7.6，7.6Hz，H-7），7.40（1H，dd，J=2.4，7.2Hz，H-6），7.10（1H，dd，J=2.4，7.2Hz，H-8），7.01（1H，br. s，H-3），7.08（1H，br. s，H-1），4.15（3H，s，H-4-OCH3）；13C-NMR（Acetone-d6，150MHz）:δ58.7（4-OCH3），102.8（C-3），108.0（C-1），114.0（C-4a），117.1（C-6），119.9（C-4b），121.2（C-8），127.1（C-10），127.5（C-9），129.8（C-7），135.1（C-8a），137.2（C-10a），155.3（C-5），156.5（C-2），157.6（C-4）。以上數據與文獻報導基本一致，故鑑定為Moscatin。
化合物2：棕色無定形粉末，EI-MS ES+：m/z244[M]+。1H-NMR（CD3OD，600MHz）：δ7.05（1H，dd，J=7.2，7.8Hz，H-4），6.65（1H，d，J=7.8Hz，H-3），6.58（1H，dd，J=2.4，7.8Hz，H-5），6.61（1H，br.s，H-1），6.22（1H，br.s，H-14），6.23（1H，br.s，H-10），6.17（1H，dd，J=1.8，2.4Hz，H-12），2.77（2H，m，H-7），2.77（2H，m，H-8），3.70（3H，s，13-OCH3）; 13C-NMR（CD3OD，150MHz）：δ39.0（C-7），39.3（C-8），55.7（13-OCH3），100.1（C-12），106.7（C-10），109.2（C-14），113.9（C-1），116.5（C-3），121.0（C-5），130.4（C-4），144.8（C-6），145.6（C-9），158.5（C-2），159.6（C-11），162.4（C-13）。以上數據與文獻報導基本一致，故鑑定為山藥素Ⅲ。
化合物3：白色針晶，EI-MS ES+：m/z216[M]+。1H-NMR（CDCl3，600MHz）：δ4.27（3H，s，H-5-OCH3），6.27（1H，d，J=9.6Hz，H-3），7.02（1H，br. s，H-3′），7.13（1H，s，H-8），7.59（1H，br. s，H-2′），8.15（1H，d，J=9.6Hz，H-4）；13C-NMR（CDCl3，150MHz）δ: 60.1（5-OCH3），93.9（C-8），105.0（C-3′），106.5（C-10），112.6（C-3），112.7（C-6），139.3（C-4），144.8（C-2′），149.6（C-5），152.7（C-9），158.4（C-7），161.2（C-2）。以上數據與文獻報導基本一致，故鑑定為香柑內酯。
化合物4：淡黃色針晶，EI-MS ES+：m/z246[M]+。1H-NMR（CDCl3，600MHz）：δ 4.19（6H，s，H-9-OCH3，H-10-OCH3），6.31（1H，d，J=9.6Hz，H-3），7.01（1H，d，J=2.4Hz，H-3′），7.64（1H，d，J=2.4 Hz，H-2′），8.14（1H，d，J=9.6Hz，H-4）；13C-NMR（CDCl3，150MHz）：δ60.4（9-OCH3），61.2（10-OCH3），104.6（C-3′），107.2（C-8a），112.4（C-3），114.4（C-6），127.8（C-8），138.9（C-4），143.2（C-4a），143.8（ C-5），144.6（C-2′），149.5（C-7），160.0（C-2）。以上數據與文獻報導基本一致，故鑑定為異茴芹素。
化合物5：淡黃色針晶，EI-MS ES+：m/z216[M]+。1H-NMR（CDCl3，600MHz）：δ 4.31（3H，s，H-8-OCH3），6.39（1H，d，J=9.6Hz，H-3），6.83（1H，d，J=2.4Hz，H- 2′），7.37（1H，s，H-5），7.71（1H，d，J=2.4Hz，H- 3′），7.78（1H，d，J=9.6Hz，H-4）；13C-NMR（CDCl3，150MHz）：δ60.8（8-OCH3），106.2（C-3′），112.4（C-5），114.3（C-3），116.0（C-10），125.6（C-6），132.3（C-8），142.5（C-9），143.8（C-4），146.1（C-2′），147.2（C-7），159.9（C-2）。以上數據與文獻報導基本一致，故鑑定為花椒毒素。
化合物6：淡黃色粉末，EI-MS ES+：m/z270[M]+。1H-NMR（CDCl3，600MHz）：δ1.73（3H，s，H-3″-CH3），1.75（3H，s，H-3″-CH3），5.01（2H，d，J=7.2Hz，H-1″），5.62（1H，t，J=7.2Hz，H-2″），6.34（1H，d，J=9.6Hz，H-3），6.82（1H，d，J=1.8Hz，H-5），7.37（1H，s，H-3′），7.70（1H，d，J=2.4Hz，H- 2′），7.71（1H，d，J=9.6Hz，H-4）；13C-NMR （CDCl3，150MHz）：δ18.4（3″-CH3），26.1（3″-CH3），70.4（C- 1″），107.0（C-3′），113.4（ C-5），115.0（C-3），115.8（C-10），120.0（C-2″），125.1（C-6），131.9（C-8），140.0（C-3″），144.1（C-9），144.6（C-4），146.9（C-2′），148.9（C-7），160.8（C-2）。以上數據與文獻報導基本一致，故鑑定為歐前胡素。
化合物7：白色針晶。與β-谷甾醇對照品共同進行TLC分析，在3種溶劑系統中展開，色譜行為完全一致，故鑑定為β-谷甾醇。
4 討論
見血清為苗族常用止血藥物，在民間的藥用歷史悠久，療效確切，值得進行深入的研究。從少數民族常用止血藥中發現新的止血藥物是創新藥物發現的重要途徑。如具有良好的止血作用的壯藥白花九裡明、彝藥「麻補」已引起中醫藥學者的關注。
本研究從見血清乙醇提取液的石油醚部位中分離得到了菲類、聯苄、香豆素及甾醇類成分，化合物3-7為首次從該屬植物中分離得到，化合物1-7為首次從見血清中分離得到。其中，1曾在同屬植物長葉羊耳蒜L.nakaharai中分離得到，2曾在同屬植物香花羊耳蒜L.odorata及L.nakaharai中分離得到，1和2分別屬於菲類和聯苄類，這兩類是蘭科特徵性成分，具有多種生物活性。3-6為香豆素類，這類成分曾在蘭科石斛屬植物中分離得到。羊耳蒜屬和石斛屬均屬於蘭科蘭亞科，兩者親緣關係較近，本實驗結果為化學分類學提供了一定的分類學證據，同時也豐富了對見血清的化學成分的認識。本課題組將繼續開展對見血清乙醇提取物大極性部位化學成分的系統研究，為其深入開發提供參考依據。
作者簡介通訊作者：劉量，女，博士，講師，主要研究方向：天然產物化學成分與生物活性。
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