組織AMPK激酶活性比色法定量檢測試劑盒

YIJI組織 AMPK激酶活性比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

YIJI組織 AMPK激酶活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過多肽底物受到 AMPK磷酸化後，進而

由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續循環法反應系統，測定產生 ADP過程中，伴隨的還原型煙醯胺腺嘌呤二核

苷酸（NADH）的氧化反應，即採用比色法測定其氧化後吸光峰值的變化，以分析組織裂解樣品中 AMPK

活性的權威而經典的技術方法。該技術由大師級科學家精心研製、成功實驗證明的。其適用於各種組織裂

解萃取液樣品（動物、人體）、部分或完全純化酶樣品中 AMPK 激酶的定量檢測，以及抑制劑和激活劑的

篩選。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，高度敏感。

技術背景

5』AMP活化蛋白激酶（5』AMP activated protein kinase；AMPK）屬於絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine

protein kinase）家屬成員之一。其為從酵母到人體高度進化保留的激酶複合物，由3個亞體，α、β、γ構

成：其中γ亞體有4個胱硫醚β合酶（cystathione beta synthase；CBS）結構域，又稱為巴特曼（Bateman）結

構域，以探測AMP和ATP的比例；α亞體含有催化結構域，一旦收到AMPKK或LKB1/MO25/STRAD 複合

物催化的磷酸化後，AMPK被激活。所有亞體都有不同異構體形式，包括α1、α2、β1、β2、γ1、γ2

和γ3。其功能在於保持細胞能量內環境恆定：促進脂肪酸β氧化、抑制膽固醇合成、促進肌肉葡萄糖吸收

和調節胰島素分泌等。AMPK在肝臟、腦和肌肉組織中高度表達。其磷酸化目標序列為 LKKLTRASFFGQ。

基於底物LKKLTRASFFGQ，在ATP的存在下，受到5』AMP活化蛋白激酶的磷酸化，獲得產物磷酸化多肽，

進而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應系統中，還

原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉化為氧化型煙醯胺腺嘌

呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其峰值的變化（340nm），來定量分析5』AMP活化

蛋白激酶的活性。其反應方式為：

產品內容

YIJI清理液（Reagent A）

YIJI裂解液（Reagent B）

YIJI緩衝液（Reagent C）

YIJI酶促液（Reagent D）

YIJI反應液（Reagent E）

YIJI底物液（Reagent F）

YIJI陰性液（Reagent G）

保存方式

保存 YIJI清理液（Reagent A）在4℃冰箱裡；其餘的保存在－20℃冰箱裡，嚴格避免光照和反覆凍

融；有效保證6月

1用戶自備

AMPK激酶：用於抑制劑篩選

1.5毫升離心管：用於樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用於樣品處理的容器

（微型）臺式離心機：用於細胞預處理

比色皿或酶標板：用於比色分析操作的容器

分光光度儀或酶標儀：用於樣品比色分析

實驗步驟

一、 待測樣品準備

1． 手術取出動物組織，並秤重 500毫克組織重量

2． （選擇步驟）放進預冷的 15毫升錐形離心管

3． （選擇步驟）加入

毫升 YIJI清理液（Reagent A）清洗

4． （選擇步驟）抽去清理液

5． 移入到一個液氮凍存管

6． 即刻放進液氮罐過夜

7． 次日從液氮罐裡取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）

8． 放進一個 15毫升錐形離心管

9． 加入置於冰槽裡的

微升 YIJI裂解液（Reagent B）

10．強力渦旋震蕩 30秒，充分混勻

11．放進冰槽裡孵育 30分鐘，期間每 10分鐘強力渦旋震蕩 30秒（注意：如需暫時停止，放進－70℃冰箱

裡儲存備用）

12．即刻放進 4℃臺式離心機離心 10分鐘，速度為 10000g

13．小心移取上清液到新的無菌的 1.5毫升離心管

14．移取 10 微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 YIJIBradford 蛋白質濃度定量試劑盒－

YJ30030.1）

15．放進－70℃的冰箱裡保存或置於冰槽裡備用

二、 測定準備

1． 準備好待測樣品（例如細胞裂解懸液等），置於冰槽裡

2． 設定好分光光度儀（溫度為 30℃）：波長為 340nm，間隔 1分鐘，讀數 6次（共 5分鐘），並置零

三、 背景對照測定

1． 移取

2． 加入

3． 加入

微升 YIJI緩衝液（Reagent C）到新的比色皿

微升 YIJI酶促液（Reagent D）

微升 YIJI陰性液（Reagent G）

4． 放進 30℃培養箱裡靜置 2分鐘

5． （選擇步驟）放進分光光度儀，置零

6． （選擇步驟）取出比色皿

2

7． 加入

8． 加入

微升 YIJI反應液（Reagent E）

微升 YIJI底物液（Reagent F）

9． 上下傾倒數次，混勻（限定在 3秒之內）

10．即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數 0分鐘 －340波長讀數 5分鐘

四、 樣品測定

1． 移取微升YIJI緩衝液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入微升 YIJI酶促液（Reagent D）

3． 加入 5微升待測樣品（注意：50微克細胞裂解懸液蛋白；樣品須溶解）

4． 放進 30℃培養箱裡靜置 2分鐘

5． （選擇步驟）放進分光光度儀，置零

6． （選擇步驟）取出比色皿

7． 加入微升YIJI反應液（Reagent E）

8． 加入升YIJI底物液（Reagent F）

9． 上下傾倒數次，混勻（限定在 3秒之內）

10．即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數：340波長讀數 0分鐘 －340波長讀數 5分鐘

五、 計算樣品活性

單位＝微摩爾 NADH/分鐘

六、酶標板測定

1． 在 96孔酶標板上做好相應標記：背景對照和樣品

2． 分別移取微升YIJI緩衝液（Reagent C）到 96孔板中

3． 分別加入微升 YIJI酶促液（Reagent D）

4． 分別加入 5微升 YIJI陰性液（Reagent G）或待測樣品（50微克細胞裂解懸液蛋白）到相應孔

中（注意：樣品須清澈）

5． 輕輕搖動 96孔酶標板

6． 在 30℃溫度下孵育 2分鐘

7． 分別加入微升YIJI反應液（Reagent E）

8． 分別加入微升YIJI底物液（Reagent F）

9． 輕輕搖動酶標板

10．即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數和 5分鐘讀數

11．活性計算：

單位＝微摩爾 NADH/分鐘

七、抑制劑篩選

3

1． 在 96孔酶標板上做好相應標記：背景、完全活性和待測抑制劑樣品

2． 按下表加入試劑

內容物

樣本背景

微升

完全酶活性

微升

待測抑制劑酶活性

微升

YIJI緩衝液

（Reagent C）

YIJI陰性液

（Reagent G）

待測抑制劑

微升

——

——

微升

——

――

微升

用戶自備的純化酶

96孔板每孔總量

微升（1毫單位）

完全活性孔

（ 微升）

微升（1毫單位）

待測抑制劑樣品孔

（ 微升）

樣本背景孔

（ 微升）

3． 輕輕搖動酶標板，混勻

4． 放進 30℃培養箱裡靜置 30分鐘

5． 分別加入

6． 分別加入

7． 分別加入

微升 YIJI酶促液（Reagent D）

微升 YIJI反應液（Reagent E）

微升 YIJI底物液（Reagent F）

8． 輕輕搖動酶標板

9． 即刻放進酶標儀檢測：獲得初始吸光讀數（OD）

10．放進 30℃培養箱裡孵育 30分鐘

11．即刻放進酶標儀檢測：獲得終點吸光讀數（OD）

12．實際吸光讀數：初始吸光讀數（OD）—終點吸光讀數（OD）

13．抑制活性計算：

1)

2)

IC50：50％抑制率所需的抑制劑濃度

3） 直接構建抑制曲線：縱座標（Y軸）為吸光讀數 OD；橫座標（X軸）為已知抑制劑濃度

注意事項

1． 本產品為 25次操作，包括背景操作

2． 操作時，須戴手套

3． 系統操作過程中，背景測定只需 1次

4． 樣品處理忌用磷酸緩衝溶液

5． 樣品須澄清，至關重要

6． 加入 YIJI底物液（Reagent F）後 3秒內即刻比色測定

7． 測定值由高到低變化；測定可持續 30分鐘

8． 比色測定後，比色皿須清洗徹底

9． 樣本測定 0分鐘讀數高於 5分鐘讀數表明具有酶活性

10．建議待測樣本蛋白濃度為 50 微克/5 微升（本公司提供 YIJIBradford 蛋白質濃度定量試劑盒－

YJ30030.1）

11．如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度

4

12．可以使用 AMPK抑制劑（DORSOMORPHIN）作為抑制劑對照或陰性對照

13．5』AMP活化蛋白激酶活性單位濃度定義：在 30℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內能夠氧化 1微摩爾

還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位

14．本公司提供系列蛋白激酶檢測試劑產品

質量標準

1．本產品經鑑定性能穩定

2．本產品經鑑定檢測敏感