Genome Biol:CRISPR技術新突破!優化sgRNA結構可提高基因編輯效率!

2016年3月3日/生物谷BIOON/--在一項新的研究中，來自美國德州理工大學健康科學中心的研究人員開發出一種提高CRISPR基因編輯效率的方法，其中CRISPR是一種日漸重要的用來編輯DNA的技術。相關研究結果近期發表在Genome Biology期刊上，論文標題為「Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency」。論文通信作者是Haoquan Wu博士。他是德州理工大學健康科學中心的一名生物醫學家。

Wu說，「全世界的科學家們如今正在他們的研究中使用CRISPR，但是這種技術的功能性並不像是它應當那樣的那麼好。」

CRISPR是一種突破性的允許科學家們對基因進行修飾的技術。兩種關鍵性的組分讓CRISPR的DNA編輯能力成為可能。第一種組分是Cas9，即一種能夠切割DNA的酶。第二種組分是單向導RNA（single guide RNA, sgRNA），它精確地引導Cas9在一種DNA序列上進行切割從而讓不需要的片段失活。

然而，作為一種新技術，CRISPR仍然還有改善的空間。這種技術剔除或敲除基因的能力並不是始終一致的。這些問題促使Wu想知道他是否能夠提高CRISPR作用於靶基因並將其移除的整體能力。為此，他想看看改變sgRNA的結構是否能夠讓這種技術變得更好。

在這項新的研究中，Wu和他的研究小組描述了他們如何能夠通過調整sgRNA模板的序列讓基於CRISPR的基因敲除能力提高了50%。他們特異性地將sgRNA延長大約5個鹼基對（bp），同時也將sgRNA中的一串胸腺嘧啶（T）的第四個鹼基T突變為胞嘧啶（C）或鳥嘌呤（G）。

Wu說，「通過這些優化，基因敲除效率提高的程度是顯著性的。這將有助降低基因敲除實驗可能並不成功的擔憂，而且也顯著增加更多充滿挑戰性的諸如基因剔除之類的基因編輯方法的效率。」

Wu和他的研究小組計劃繼續研究這種經過修飾的sgRNA模板以便更好地理解它為何提高CRISPR的基因編輯功能。他們已經將這種新的方法申請了專利。（生物谷 Bioon.com）

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doi:10.1186/s13059-015-0846-3

Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency

Ying Dang, Gengxiang Jia, Jennie Choi, Hongming Ma, Edgar Anaya, Chunting Ye, Premlata Shankar and Haoquan WuEmai

Background
Single-guide RNA (sgRNA) is one of the two key components of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 genome-editing system. The current commonly used sgRNA structure has a shortened duplex compared with the native bacterial CRISPR RNA (crRNA)–transactivating crRNA (tracrRNA) duplex and contains a continuous sequence of thymines, which is the pause signal for RNA polymerase III and thus could potentially reduce transcription efficiency.

Results
Here, we systematically investigate the effect of these two elements on knockout efficiency and showed that modifying the sgRNA structure by extending the duplex length and mutating the fourth thymine of the continuous sequence of thymines to cytosine or guanine significantly, and sometimes dramatically, improves knockout efficiency in cells. In addition, the optimized sgRNA structure also significantly increases the efficiency of more challenging genome-editing procedures, such as gene deletion, which is important for inducing a loss of function in non-coding genes.

Conclusions
By a systematic investigation of sgRNA structure we find that extending the duplex by approximately 5 bp combined with mutating the continuous sequence of thymines at position 4 to cytosine or guanine significantly increases gene knockout efficiency in CRISPR-Cas9-based genome editing experiments.