從基因編輯狗談CRISPR/Cas9

近日，中國科學家利用基因編輯技術——CRISPR/Cas9，對抑制狗骨骼肌生長的基因（MSTN）進行了敲除，培育出兩隻肌肉發達的「大力神」狗，成功構建了世界首個基因敲除狗模型。

科研人員所使用的「基因編輯技術」，顧名思義，能夠讓人類對目標基因進行「編輯」，實現對特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技術自問世以來，就有著其它基因編輯技術無可比擬的優勢，技術不斷改進後，更被認為能夠在活細胞中最有效、最便捷地「編輯」任何基因。

一、與諾獎「擦肩而過」的CRISPR/Cas9技術

這不是CRISPR/Cas9這項明星技術第一次得到人們的關注。在此之前，有著「豪華版」諾獎之稱的「2015年度生命科學突破獎」頒發給了發現基因組編輯工具「CRISPR/Cas9」的兩位美女科學家——珍妮弗·杜德娜和艾曼紐·夏邦傑。二人更是獲得了2015年度化學領域的引文桂冠獎——素有諾獎「風向標」之稱，曾被認為是今年諾貝爾化學獎的最有力競爭者。

那CRISPR/Cas9到底是一項什麼技術，為何能夠獲得如此這般青睞，又何以在短短兩三年時間內，發展成為生物學領域最炙手可熱的研究工具之一，並有近700篇相關論文發表？它將來又會如何影響到我們的生活？

CRISPR/Cas9是繼「鋅指核酸內切酶（ZFN）」、「類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALEN）」之後出現的第三代「基因組定點編輯技術」。與前兩代技術相比，其成本低、製作簡便、快捷高效的優點，讓它迅速風靡於世界各地的實驗室，成為科研、醫療等領域的有效工具。

二、CRISPR/Cas系統的靈感來源

CRISPR/Cas9技術的靈感來源於細菌的一種獲得性免疫系統。與哺乳動物的二次免疫應答類似，細菌在抵抗病毒或外源質粒入侵時，會產生相應的「記憶」，來抵抗該種外源遺傳物質的再次入侵，而這種獲得性免疫正是由細菌的CRISPR/Cas系統實現的。

在細菌的基因組上，存在著串聯間隔排列的「重複序列」，這些重複序列相對保守，我們稱之為CRISPR序列（Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats—成簇的規律間隔的短回文重複序列）。

1、「記錄」入侵者檔案

其中的「間隔序列」來源於病毒或外源質粒的一小段DNA，是細菌對這些外來入侵者的「記錄」。（如圖A所示）。

圖1 CRISPR序列示意圖

其中，菱形框表示高度可變的間隔序列，正方形表示相對保守的重複序列，　　病毒或外源質粒上，存在「原間隔序列」，「間隔序列」正是與它們互相對應。「原間隔序列」的選取並不是隨機的，這些原間隔序列的兩端向外延伸的幾個鹼基往往都很保守，我們稱為PAM（Protospacer adjacent motifs-原間隔序列臨近基序）。

當病毒或外源質粒DNA首次入侵到細菌體內時，細菌會對外源DNA潛在的PAM序列進行掃描識別，將臨近PAM的序列作為候選的「原間隔序列」，將其整合到細菌基因組上CRISPR序列中的兩個「重複序列」之間。這就是「間隔序列」產生的過程。

2、打擊二次入侵者

當外源質粒或病毒再次入侵宿主菌時，會誘導CRISPR序列的表達。同時，在CRISPR序列附近還有一組保守的蛋白編碼基因，稱為Cas基因。CRISPR序列的轉錄產物CRISPR RNA和Cas基因的表達產物等一起合作，通過對PAM序列的識別，以及「間隔序列」與外源DNA的鹼基互補配對，來找到外源DNA上的靶序列，並對其切割，降解外源DNA。這也就實現了對病毒或外源質粒再次入侵的免疫應答。

正是基於細菌的這種後天免疫防禦機制，CRISPR/Cas9技術應運而生，從而使科學家們利用RNA引導Cas9核酸酶實現對多種細胞基因組的特定位點進行修飾。

三、CRISPR/Cas9技術的實現需要什麼？

在CRISPR/Cas9技術中，我們把即將被編輯的細胞基因組DNA看作病毒或外源DNA。基因編輯的實現只需要兩個工具——嚮導RNA（guide RNA， gRNA）和Cas9蛋白。

其中，嚮導RNA的設計並不是隨機的，待編輯的區域附近需要存在相對保守的PAM序列（即三鹼基序列NGG，其中N可以是任意鹼基），而且嚮導RNA要與PAM上遊的序列鹼基互補配對。以基因敲除為例，如圖3所示，在待敲除基因的上下遊各設計一條嚮導RNA（嚮導RNA1，嚮導RNA2），將其與含有Cas9蛋白編碼基因的質粒一同轉入細胞中，嚮導RNA通過鹼基互補配對可以靶向PAM附近的目標序列，Cas9蛋白會使該基因上下遊的DNA雙鏈斷裂。

對於DNA雙鏈的斷裂這一生物事件，生物體自身存在著DNA損傷修復的應答機制，會將斷裂上下遊兩端的序列連接起來，從而實現了細胞中目標基因的敲除。

圖2 CRISPR/Cas9技術敲除掉部分基因原理圖（繪圖 肖媛）　　

而DNA片斷的插入或定點突變的實現，只需在此基礎上為細胞提供一個修復的模板質粒，這樣細胞就會按照提供的模板在修復過程中引入片段插入或定點突變，對受精卵細胞進行基因編輯，並將其導入代孕母體中，可以實現基因編輯動物模型的構建。

圖3 CRISPR/Cas9技術插入新基因原理圖（繪圖 肖媛）　　

當然，CRISPR/Cas9技術的成功率並非百分之百。嚮導RNA靶向序列的非特異性，以及DNA損傷修復的不確定性，都可能會導致基因組上其它位置產生未知的突變，也就是所謂的「脫靶」現象，這也是現階段影響CRISPR/Cas9技術應用的瓶頸之一。但隨著科研人員不斷對Cas9蛋白的優化改造，對靶基因識別特異性的增強， CRISPR/Cas9技術的「打靶」效率將不斷提高。

四、CRISPR/Cas9的前景如何？

CRISPR/Cas9技術在醫療健康、生產生活、家畜育種等領域的應用，不斷取得喜人的新成果。

如在醫療健康領域，用iPS細胞（誘導多能幹細胞）治療人類的鐮刀形貧血症，可以將病人的皮膚細胞誘導成iPS細胞，利用CRISPR/Cas9技術介導同源重組來修復發生突變的血紅蛋白基因，再將修復的iPS細胞定向誘導分化為造血幹細胞移植到病人體內。此外，像使用CRISPR技術根除HIV病毒、誘導宮頸癌細胞自我毀滅、構建癌症模型等最新成果先後被Nature等著名雜誌所報導。在奶製品的發酵中，利用CRISPR/Cas9增強發酵菌株對噬菌體的防禦能力；在家畜育種方面，也正在利用基因編輯工具通過對顯著影響家畜生產性能的基因位點進行改良，以實現豬、牛、羊等大型家畜生產性能的提高等。

但正如科學是把雙刃劍，任何新技術的出現都少不了其反對者的存在，在CRISPR/Cas9技術得到熱烈呼聲的同時，不少人也對它提出了質疑，特別是對其脫靶事件可能導致基因組其他位置產生未知突變表示擔憂。

作為生命科學領域的一項重大突破，筆者認為CRISPR/Cas9的創新性、技術性毋庸置疑，隨著對CRISPR系統認識的加深，實驗設計的優化改造，相信其打靶效率會進一步提高，CRISPR/Cas9以及其衍生技術終究會帶來一場科學史上的巨大變革。期待在不久的將來，CRISPR/Cas9所帶來的巨大轉變必將能夠惠澤萬家，到時候屬於它的諾獎終將到來。

原文標題：「基因敲除狗」怎麼造出來的？編輯目標基因

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參考文獻：

[1]Doudna， J.A。； Charpentier， E。， Genome editing。 The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9。 Science， 2014， 346， （6213）， 1258096。[圖片來源]

[2] Fang， R。； Chang， F。； Sun， Z。-L。； Li， N。； Meng， Q。-Y。， New Method of Genome Editing Derived From CRISPR/Cas9。 Acta Agronomica Sinica， 2013， 40， （8）， 691。