重組人蛋白細胞因子常見問題分析

　　1．     重組蛋白分類

A.按蛋白分類	B.按種屬分類
a.細胞因子(Cytokines)	a.人(Human)
b.生長因子(GrowthFactors)	b.小鼠(Mouse)
c.趨化因子(Chemokines)	c.大鼠(Rat)
d.激素(Hormones)	d.猴(RhesusMacaque)
e.神經營養因子(Neurotrophins)	e.豬(Porcine)
f.酶&酶抑制劑(Enzymes&Inhibitors)	f.狗(Canine)
g.其他(Others)	g.牛(Bovine)
B.按種屬分類	h.其他(Others)

　　2．重組蛋白表達體系

　　 

　　MCE重組蛋白表達體系主要有：大腸桿菌，酵母細胞，昆蟲細胞和哺乳動物

　　細胞。

　　3．重組蛋白純度和濃度測定

　　 

　　重組蛋白純度測定方法：a.SDS-PAGE測定法；b.HPLC測定法；c.銀染測

　　定法。

　　重組蛋白濃度測定方法：a.Bradford蛋白定量測定法；b.BCA蛋白定量測

　　定法；c.SDS-PAGE蛋白定量測定法。

　　4．重組蛋白運輸狀態

　　 

　　MCE的大部分重組蛋白產品為凍乾粉，在室溫環境中都是穩定的，一般採用

　　藍冰或是室溫運輸。

　　5．重組蛋白表達體系對比

表達體系	優缺點
原核體系	繁殖快、成本低，產量高，但不能進行糖基化修飾，常為包涵體
哺乳動物細胞	結構與天然蛋白最接近，完善的翻譯後加工，活性更好，但表達水平較低，周期長，技術要求高
酵母細胞	易操作，蛋白背景弱，適合大規模生產，便於純化，但存在產量不高以及糖基化達不到要求等問題
昆蟲細胞	功能與天然蛋白相似，對於部分有毒性或較難表達蛋白有優勢，但糖基化程度低，形式比較單一，活性不如哺乳動物細胞表達系統

　　6．重組蛋白表達體系選擇

　　 

研究目的	蛋白要求	最適表達系統
用作抗原，獲得特異性抗體	純度>80%，不需要蛋白修飾或天然活性，可帶標籤	原核表達體系
用於檢測蛋白質結晶及晶體結構研究	純度>95%，濃度通常在10mg/mL	2/3是原核表達體系，1/3是昆蟲細胞表達體系與哺乳動物細胞表達體系
蛋白的功能研究	需要保存蛋白的天然活性	原核表達體系和真核表達體系
用於藥物研究的蛋白質	一般要求儘量保存天然序列，具有天然活性	真核表達體系

　　7重組蛋白開蓋使用前處理

　　 

　　為防止凍乾粉產品的粉末沾在管壁或管蓋上，使用前請勿開蓋，離心(約

　　13000rpm)處理20-30秒，使附於管蓋或管壁的蛋白收集於管底。MCE保

　　證每管產品的蛋白總量達到標示含量。

　　8．重組蛋白復溶

　　 

　　a.使用前先離心(約13000rpm)處理20-30秒，使附於管蓋或管壁的蛋白

　　收集於管底。

　　b.嚴格依據說明書，使用推薦的溶液將蛋白凍乾粉溶解至推薦的濃度。大

　　多數重組蛋白建議溶解在滅菌超純水中，濃度不低於100μg/mL，以便於

　　後續進一步稀釋至工作濃度。

　　c.用移液槍輕吹混勻，或將管蓋蓋好後輕柔顛倒數次進行混勻，低速離心

　　數秒。

　　d.復溶後的重組蛋白在室溫放置數分鐘，以保證蛋白能夠充分溶解。

　　9.重組蛋白儲存

　　 

　　由於每次凍融都會造成蛋白的部分變性，因此建議客戶收到產品後適量分

　　裝避免反覆凍融。

　　a.短期儲存：

　　凍乾粉狀態產品在室溫下存放3周，不影響活性。

　　復溶後的產品在4℃可穩定儲存1-2周。

　　b.長期儲存：

　　凍乾粉狀態產品在-20℃下，可穩定保存至少一年；推薦-80℃長期保存，

　　以獲得更穩定性能的產品。

　　可選擇包含一定濃度載體蛋白(0.1%BSA，5%HSA，10%FBS，或5%海

　　藻糖)的溶液或培養基復溶產品，分裝後凍存於-20℃下，可保存至少三個

　　月；推薦-80℃長期保存，以獲得更穩定性能的產品。

　　註：分裝凍存時，蛋白濃度不低於100ng/μL，且每管的體積不可小於20

　　μL。

　　10．載體蛋白介紹

　　 

　　載體蛋白主要用於提升重組蛋白復溶後的穩定性，同時也有利於避免產品

　　粘附在管壁上。例如：HSA,BSA。

　　11.重組蛋白標籤影響

　　 

　　蛋白標籤指重組蛋白製備過程中與目的蛋白融合表達的蛋白或多肽。MCE

　　的重組蛋白產品大部分為無標籤狀態，但少數重組蛋白產品因為不同目的

　　需要加有標籤。

　　a.標籤利於蛋白純化。

　　b.當目的蛋白無特定抗體直接鑑定，可利用標籤進行WesternBlot或

　　ELISA分析方法鑑定。

　　c.Fc標籤可以提升重組蛋白的半衰期以提高分子的穩定性，同時也能夠促

　　進重組蛋白形成活性二聚體。

　　重組蛋白標籤對蛋白的生物學活性影響存在未知結論，但對大部分檢測應

　　用中，重組蛋白的標籤對蛋白本身生物學活性並無影響，所以無需移除。

　　MCE對重組蛋白產品都已經做過生物學活性檢測並將數據公示於COA中。

　　12.重組蛋白活力值與計算方法

　　 

　　MCE重組蛋白的生物學活性(ED50)測定數據在COA中可以獲得。ED50是

　　EffectiveDose50的縮寫，是可誘導50%最大反應的蛋白濃度(ng/mL)。

　　計算公式如下:

　　

　　MCE的重組蛋白產品並未採用WHO(NationalInstituteforBiological

　　StandardsandControl)設定的標準來測定活力值，以上計算公式並不適

　　用於「InternationalUnits」和「ED50」的轉換關係，需要採用國際標準品

　　對比相同實驗獲得該重組蛋白的IU值。

　　13.重組蛋白ED50值的批間差

　　 

　　不同批次的產品或不同實驗方法的測定都會導致重組蛋白產品的ED50值變

　　化，我們推薦客戶根據自己的實驗測定得到最合適的實際ED50值。

　　14.重組蛋白應用方案

　　 

　　MCE重組蛋白產品的COA中顯示的實驗方案只是確認該產品的ED50值，

　　但並不與終端客戶的不同類型實驗結果存在等效性。如果客戶需要應用在

　　不同於本公司產品測試的實驗方法時，我們建議客戶通過實際測試獲得最

　　佳ED50值。

　　15.重組蛋白的種屬交叉活性

　　 

　　重組蛋白的種屬交叉活性需要根據具體產品而定；建議儘量選擇對應種屬

　　的重組蛋白。如實在無法匹配種屬，以下信息供參考：

　　a.大多數人細胞因子對小鼠細胞有效(僅少數例外)。

　　b.多數小鼠細胞因子對人細胞有效，但特異性可能不強。如小鼠的表皮生

　　長因子(EGF)對人的表皮細胞有活性，對人的其他種類細胞可能也有作用。

　　c.幹擾素、GM-CSF、IL-3、IL-4具有種屬特異性，即重組人的這些細胞因

　　子只能作用於人細胞，對小鼠和大鼠等其他種而重組小鼠的這些細胞因子

　　也僅用於小鼠，對人的細胞無效。

　　d.成纖維細胞生長因子(FGFs)、神經營養素(Neurotrophins，如BDNGF、

　　GDNF、CNTF、β-NGF等)、TGF-β等高度保守，各種屬間交叉活性強。