Cell:利用CRISPR/Cas9系統精確標記發育大腦中的內源性蛋白

2020-11-27 生物谷

2016年5月15日/生物谷BIOON/--在一項新的研究中，來自美國馬克斯普朗克佛羅裡達神經科學研究所（Max Planck Florida Institute of Neuroscience, MPFI）的Ryohei Yasuda博士和他的團隊開發出一種被稱作SLENDR的方法，這種方法允許對活組織樣品中的神經元DNA進行精確修飾。利用這種新技術，研究人員能夠可靠地在同一個細胞中利用不同的顏色同時對兩種不同的蛋白進行標記。他們利用多種成像方法和DNA測序證實這種SLENDR方法真正地和準確地敲入基因。相關研究結果於2016年5月12日在線發表在Cell期刊上，論文標題為「High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing」。SLENDR的全稱為CRISPR/Cas9介導同源重組修復對內源性蛋白進行單細胞標記 （single-cell labeling of endogenous proteins by CRISPRCas9-mediated homology-directed repair）。

在這項研究中，研究人員努力理解當我們學習和形成記憶時，我們大腦中的細胞發生變化的方式。但是這個領域的研究受到限制的原因在於缺乏允許科學家們定位和可視化觀察單個神經元內單個蛋白的技術。當前的成像方法並不提供足夠強的特異性、對比度和解析度來觀察不同的蛋白。此外，這些成像方法耗時耗力而且成本高昂；它需要一到兩年的時間開發基因改造模型。但是在研究員Jun Nishiyama博士和博士後研究員Takayasu Mikuni博士了解到DNA基因編輯技術CRISPR/Cas9後，他們有了新的想法。

CRISPR是一種存在於細菌DNA中的工具，這些單細胞有機體利用它來抵抗病毒感染。當病毒入侵和試圖將它的傳染性DNA插入到細菌細胞的DNA中時，細菌DNA中被稱作CRISPR的特殊片段切割病毒DNA，使得後者不能夠造成嚴重破壞。

科學家們已開始利用CRISPR/Cas9切割細胞和除細菌之外的有機體中的特異性基因。當這種切割產生時，細胞採用兩種方法來修復它的DNA。一種方法是同源重組修復（homology-directed repair, HDR），另一種是非同源末端接合（non-homologous end joining, NHEJ）。HDR是更加準確的，重建或替換受損的基因，而NHEJ降解受損的基因，並將留下來的末端重新連接在一起，這經常會阻止受損基因的表達，但是不會替換它。

如果細胞利用HDR進行自我修復，那麼科學家們能夠往CRISPR系統中加入一種所需的基因，它將被插入到細胞DNA中替換受損的基因。不過，很多科學家們認為一旦細胞停止分裂，它通常採用NHEJ而不是HDR來修復任何斷裂的DNA。

儘管CRISPR系統強大的基因編輯能力讓人印象深刻，但是它很少在操縱腦細胞DNA中取得成功，這是因為在大腦形成時，它的細胞不再分裂。儘管科學家們能夠利用CRISPR相對容易地敲除大腦中的某些基因，但是細胞分裂的缺乏使得他們很難通過HDR可靠地和精確地敲入所需的基因。

為此，Yasuda和他的團隊開發出一種他們稱之為SLENDR的方法，該方法能夠被用來準確地修飾活組織樣品中的神經元DNA。在實驗性模型中，研究人員選擇子宮內電穿孔技術，該技術允許他們將CRISPR/Cas9系統插入到仍然在發育和分裂的胎兒期腦細胞中。因此，發生斷裂的DNA仍然通過HDR進行修復，這就允許研究人員導入一種能夠在顯微鏡下可視化觀察感興趣蛋白的基因。他們甚至能夠可靠地在同一個細胞中利用不同的顏色同時對兩種不同的蛋白進行標記。他們利用多種成像方法和DNA測序證實這種SLENDR方法真正地和準確地敲入基因。

在測試這種新技術時，研究人員觀察到蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）α亞型的一種之前未曾描述的行為。在發育早期，大約在出生7天後，PKC α亞型被發現在神經元細胞膜中簇集，這提示著它是高度有活性的，然而在出生一個月後，它在整個神經元中廣泛地擴散，這提示著在發育後期，它不再是高度有活性的。

Yasuda說，「我認為SLENDR將是一種研究分子與細胞神經生物學的標準工具。SLENDR提供一種有價值的方法來確定蛋白的亞細胞位置，這將有助研究人員確定這些蛋白的功能。」（生物谷 Bioon.com）

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High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing

doi:10.1016/j.cell.2016.04.044

Takayasu Mikuni, Jun Nishiyama, Ye Sun, Naomi Kamasawa, Ryohei Yasuda

A scalable and high-throughput method to identify precise subcellular localization of endogenous proteins is essential for integrative understanding of a cell at the molecular level. Here, we developed a simple and generalizable technique to image endogenous proteins with high specificity, resolution, and contrast in single cells in mammalian brain tissue. The technique, single-cell labeling of endogenous proteins by clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9-mediated homology-directed repair (SLENDR), uses in vivo genome editing to insert a sequence encoding an epitope tag or a fluorescent protein to a gene of interest by CRISPR-Cas9-mediated homology-directed repair (HDR). Single-cell, HDR-mediated genome editing was achieved by delivering the editing machinery to dividing neuronal progenitors through in utero electroporation. We demonstrate that SLENDR allows rapid determination of the localization and dynamics of many endogenous proteins in various cell types, regions, and ages in the brain. Thus, SLENDR provides a high-throughput platform to map the subcellular localization of endogenous proteins with the resolution of micro- to nanometers in the brain.

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