Cell:NF-kB 105蛋白泛素化激活新機制

2015年4月10日 訊 /生物谷BIOON/ --NF-kB是一類十分重要的轉錄因子，它參與了包括免疫與炎症反應，細胞存活與凋亡，增殖分化等過程。150年前左右，Rudolf Virchow發現了淋巴細胞向腫瘤內部浸潤的現象，從而提出了慢性炎症與腫瘤惡化之間的聯繫。最近的一系列研究發現NF-kB參與了調控這一聯繫的內在機制。

NF-kB在腫瘤發生過程中的作用十分複雜。一些研究發現NF-kB在腫瘤細胞內部大量表達，從而提高了抗凋亡分子的水平（如X-IAP等）；然而，另外一些研究則認為NF-kB具有抗腫瘤的作用。例如，NF-kB被發現能夠誘導T細胞激活後的凋亡反應。

 

NF-kB家族的成員基本以異源二聚體的方式存在。其中一個亞基為p52/p50蛋白，它們分別由p100/p105蛋白經過泛素介導的剪切過程由未激活狀態變為激活狀態。另外一個亞基由Rel家族蛋白構成（RelA-p65，RelB，c-Rel）。有時候p52與p50能夠相互結合形成同源複合體，但這種複合體由於缺少反式激活結構域而沒有轉錄調控活性。在未激活狀態下，NF-kB停留在胞漿中，並通過錨蛋白重複序列（ankyrin repeats）與IkB蛋白結合，保持抑制狀態。許多不同種的胞外刺激信號能夠促進IkB蛋白的降解，從而釋放NF-kB二聚體進入胞內開啟轉錄調控功能。

 

最近一期的《cell》雜誌上，來自以色列的科學家Aaron Ciechanover等人發表了他們對於p105蛋白切割的新機制的研究成果，並進一步說明了這一機制對於腫瘤抑制的重要作用。

 

由於目前為止，具體介導p105蛋白切割的E3泛素連接酶還沒有鑑定出來，作者因此設計了非常系統的體外純化方法：以兔源網織紅血球細胞裂解液為樣本，經過一系列色譜純化步驟分成分子量由小到大的若干組分，然後利用體外重建的系統檢測這些組分是否具有泛素化標記p105蛋白的能力。在有特異性泛素連接酶活性的組分中進一步通過質譜的方式對其中的蛋白質成分進行鑑定。通過最終的序列對比，作者們發現了其中有相當多的多肽與KPC1蛋白序列相符（58條），而且覆蓋了整個開放閱讀框（opening reading frame）的將近一半，另外也有相當一部分多肽序列屬於KPC2蛋白。這一方法預示了KPC對p105泛素化的作用。

 

KPC的全稱叫做KIP1 ubiquitination promoting complex，它是一類E3連接酶。為了證明KPC對p105蛋白的泛素化連接作用，作者利用體外重建系統將純化得到的KPC1與體外翻譯得到的 S35標記的p105蛋白共同孵育。在有E1與E2存在的情況下，KPC1能夠引起p105的泛素化，而其酶活性缺失突變體則沒有這一功能。

 

為了證明KPC1在細胞環境中也有此活性，作者在HEK293細胞中過表達了flag-p105與HA-ubiquitin，並分別過表達或抑制了KPC1的含量（分別為myc-KPC1或siRNA-KPC1）。免疫共沉澱實驗結果顯示：KPC1的過表達能夠明顯引起p105的泛素化，並能夠導致p105的切割。進一步的免疫共沉澱實驗也發現了KPC1與p105的相互作用。

 

接下來，作者通過RNA幹擾的方式抑制了HEK細胞內源KPC1的活性，生化檢測結果顯示：p105的切割明顯受到了影響。為了探究這一作用在受到上遊信號刺激時是否發生變化，作者向HEK293系統中加入了穩定激活的IKKb蛋白。檢測結果顯示：IKKb的加入能夠增強KPC1的切割活性，這一活性也能被siRNA所抑制。之後，作者利用人源的單倍體細胞系HAP1，並通過CRISPR-cas9工具分別敲除了其中的KPC1或KPC2。之後，作者將兩株突變株與野生型分別接受TNF-a刺激或對照處理。生化檢測結果顯示：TNF-a刺激後野生型細胞出現了p105的切割，而這一現象在突變體細胞系中受到了抑制。這些實驗結果說明了KPC蛋白對於p105的切割在穩態下與激活狀態下均可發生。為了進一步研究KPC切割p105的內在機制，作者檢測了穩定活化IKKb存在的條件下KPC1與p105的相互作用。結果顯示：在有穩定活化的IKKb的存在條件下，KPC1與p105的相互作用得到了增強。

 

接下來，作者研究了KPC2在此過程中的作用。通過體外重組系統以及細胞水平的生化檢測實驗，作者發現KPC2能夠減弱KPC1對p105的泛素化作用。

 

之後，作者通過突變實驗得出：KPC1對於p105的泛素化修飾可能發生在p105的C端位置。由於p105的C端包括許多不同的結構域，作者通過對半截斷的突變實驗證明p105蛋白的泛素化與其501-969之間的序列有關，而與其N端1-434之間的序列沒有關係。進一步的突變實驗鎖定了p105蛋白C端的錨蛋白重複序列（AR）在其泛素化過程中的作用。

 

到此為止，作者清楚地揭示了NF-kB p105蛋白泛素化切割的工作機制。那麼這一機制對於其功能的實驗又有什麼影響呢？作者通過體外轉染一系列不同的癌細胞系，發現KPC1的過表達能夠抑制細胞的生長，而轉染沒有酶活性的突變體KPC1則沒有這一效果。說明KPC1的連接酶活性能夠抑制腫瘤的發生。最後，作者檢測了不同階段的頭頸癌樣本中KPC1以及p50的含量，結果顯示：隨著病情的惡化，KPC1以及p50的活性逐漸降低。這一結果也符合KPC1抑制腫瘤發生的內在作用。（生物谷bioon.com）

 

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KPC1-Mediated Ubiquitination and Proteasomal Processing of NF-kB p105 to p50 Restricts Tumor Growth

 

Yelena Kravtsova-Ivantsiv, Inna Shomer, Victoria Cohen-Kaplan, Berend Snijder, Giulio Superti-Furga, Hedva Gonen, Thomas Sommer, Tamar Ziv, Arie Admon, Inna Naroditsky, Muhammad Jbara, Ashraf Brik, Eli Pikarsky, Yong Tae Kwon, Ilana Doweck, and Aaron Ciechanover

 

NF-kB is a key transcriptional regulator involved in inflammation and cell proliferation, survival, and

transformation. Several key steps in its activation are mediated by the ubiquitin (Ub) system. One uncharacterized step is limited proteasomal processing of the NF-kB1 precursor p105 to the p50 active subunit. Here, we identify KPC1 as the Ub ligase (E3) that binds to the ankyrin repeats domain of p105, ubiquitinates it, and mediates its processing both under basal conditions and following signaling. Overexpression of KPC1 inhibits tumor growth likely mediated via excessive generation of p50. Also, overabundance of p50 downregulates p65, suggesting that a p50-p50 homodimer may modulate transcription in place of the tumorigenic p50-p65. Transcript analysis reveals increased expression of genes associated with tumor-suppressive signals. Overall, KPC1 regulation of NF-kB1 processing appears to constitute an important balancing step among the stimulatory and inhibitory activities of the transcription factor in cell growth control.