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點評 | 劉衝（浙江大學），王曉群（中科院生物物理所）
膠質母細胞瘤（Glioblastoma，GBM）是發病率和致死率最高的原發性腦腫瘤，具有高度異質性和放化療抗性，治療後中位生存期僅為十五個月。GBM預後極差的一個重要原因是缺乏有效的早期診斷和幹預手段。超過90%的GBM屬於原髮型GBM（primary GBM），診斷時已是終末期，臨床上觀測不到癌前病變或低等級腫瘤，但基因組數據推算在確診前2-7年GBM起源細胞就已開始發生惡性轉變。Luis Parada/Sheila Alcantara Llaguno、Yuan Zhu/汪源、Hui Zong/劉衝等團隊通過多種轉基因小鼠模型證明，GBM最可能的起源細胞是側腦室下區（Subventricular zone, SVZ）神經幹細胞（Neural stem cell, NSC）和腦實質中廣泛存在的少突膠質細胞前體（Oligodendrocyte precursor cell, OPC）【1-4】。2018年的一項研究發現GBM患者SVZ細胞存在低水平驅動突變，突變類型與遠端腫瘤細胞一致，進一步支持了從人神經幹細胞（human NSC, hNSC）到GBM的演化路徑【5】。但hNSC在腫瘤發生進程中如何動態演化形成高度異質的GBM長期處於黑盒子狀態，也不清楚是否存在一個時間窗口可以對GBM進行早期診斷和預防性治療。
由於關注的是腫瘤形成前的生物學過程，此方面研究面臨兩方面技術挑戰。首先，與結直腸癌等易於進行早期取樣的腫瘤不同，原髮型GBM在臨床上無法觀測到早期病變，難以獲得早期樣本進行分析。其次是缺乏理想的臨床前動物模型。領域內廣泛應用的病人源異種移植（Patient-derived xenograft, PDX）模型（包括膠質瘤幹細胞移植模型）反映的是終末期腫瘤的性質。而現有的GBM轉基因小鼠模型由於存在人鼠腫瘤差異以及成瘤位置的不確定性，對於模擬和分析hNSC的成瘤路徑也不夠理想。
2021年1月4日，四川大學華西醫院生物治療國家重點實驗室汪源/陳路/張燕組課題組在Cell Research 雜誌在線發表題為「Sequential fate-switches in stem-like cells drive the tumorigenic trajectory from human neural stem cells to malignant glioma」的研究論文。
該研究中，作者通過基因編輯敲除hNSC中GBM相關抑癌基因成功構建了多個高成瘤率的惡性膠質瘤新模型。這些模型很好的模擬了患者 GBM的病理和分子特徵。通過多組學時序分析，作者在多時間點、多層次、單細胞精度揭示了hNSC在體內發生惡性轉化形成腫瘤的全景圖譜，確立了時間點特異的動態轉錄調控機制，發現了一系列新的潛在促瘤因子並對其中的C1QL1進行了功能驗證。通過構建腫瘤發生樹和譜系追蹤實驗，作者發現了一種在成瘤過程中持續存在的NSC-like細胞，其在成瘤過程中發生多次命運轉變，分時、依序產生不同的惡性譜系。在早期關鍵時間點針對這些細胞進行短時程靶向幹預即可有效抑制腫瘤發生，證明存在潛在早期診療時間窗口。
hNSC源惡性膠質瘤新模型
作者使用了一株可在多西環素誘導下穩定表達Cas9的人胚胎幹細胞系iCas9-Hues8，將其向神經譜系誘導分化，建立了iCas9 hNSC細胞系。隨後利用基因編輯在iCas9 hNSC中引入不同的GBM驅動突變組合和譜系追蹤標記mCherry，再進行原位移植，構建了多種原位原發的惡性膠質瘤新模型。此類模型基因編輯效率很高，可以一次性引入多個驅動突變，不需要進行單克隆篩選即可形成腫瘤。其中，TP53/NF1雙突變組合（TN組）惡性成瘤率94%，TP53/NF1/PTEN突變組合（TNP組）惡性成瘤率100%。終末期腫瘤大範圍侵襲包括小鼠SVZ區在內的雙側腦區, 很好的模擬了GBM的病理特徵。組織轉錄組和單細胞轉錄組分析表明，TN和TNP腫瘤在轉錄水平也模擬了GBM的分子特徵和異質性。
hNSC正常分化和癌化的重要分歧點
為重建hNSC到惡性膠質瘤的成瘤路徑，作者在腫瘤進程中的四個時間點（T0：起始TNP hNSC細胞；T1：移植後一月；T2：移植後2月；End/End_SVZ: 終末腫瘤和腫瘤侵潤的SVZ區）進行多個體取樣用於全外顯子組、組織轉錄組和單細胞轉錄組測序，並在平行時間點收集了對照hNSC移植組數據。作者首先通過組織轉錄組分析擬合了對照hNSC的正常分化軌跡和突變hNSC的癌化軌跡，發現T2是兩條軌跡的重要分歧點，大量膠質瘤相關基因在此時間點爆發式差異表達。組織切片染色也表明，T2期TNP細胞雖未形成終末期腫瘤，卻相較T1期表現出更為明顯的惡性特徵。
NSC-like細胞的命運轉變推動腫瘤進程
作者進一步通過單細胞轉錄組分析構建了腫瘤發生樹，發現了一群在腫瘤進程中持續存在、保持增殖的NSC-like細胞亞群。這些細胞在腫瘤發生樹的分布提示其在成瘤過程中發生了多次命運改變，分時、依序產生神經元樣（Neuron-like）、星形膠質細胞樣（AC-like）和少突膠質細胞樣（OC-like）細胞。三個時間段的BrdU體內譜系追蹤實驗證實了這些細胞的存在及其命運轉變。有意思的是，各時間點全外顯子組測序並未發現克隆水平的額外驅動突變或細胞命運調控因子突變，證明hNSC在獲得所有必須的驅動突變後還需要經過複雜的命運決定機制才能形成腫瘤，其命運轉變可能與體內微環境誘導的表觀遺傳改變有關，提示命運決定因子和驅動基因協同促進腫瘤發生。對GBM患者樣本單細胞數據分析表明，GBM樣本中也存在NSC-like細胞，不同GBM樣本的NSC-like細胞分別表現出T1/T2、T2和End期特徵，證明了前述發現的臨床相關性。
早期短時程靶向幹預可以阻斷hNSC的成瘤路徑
作者通過Pseudotime擬時分析追蹤了NSC-like細胞在成瘤過程中的分子演進並與王曉群組發表的發育期人腦海馬單細胞數據進行比較【6】，發現了時間點特異的腫瘤發生調控網絡和一系列新的潛在促瘤因子如C1QL1，並通過體外細胞實驗和體內成瘤實驗證明過表達C1QL1可以促進腫瘤形成。作者進一步針對NSC-like細胞成瘤過程中持續上調的AP-1基因，使用一種已進入臨床二期的特異性靶向抑制劑T5224，在三個時間點對小鼠進行預防性給藥10天，發現早期而非後期短時程靶向幹預可以有效的抑制膠質瘤發生並顯著延長小鼠生存期，證明存在潛在的早期診療時間窗口。
總的來說，本研究確立了新的高效建模方法，並以此為基礎全景式展示了從hNSC到惡性膠質瘤的癌化路徑和細胞分子圖譜，對理解GBM發病機制和異質性形成原理並在此基礎上開發臨床早期診療策略具有重要意義。
據悉，四川大學生物治療國家重點實驗室博士生王曉飛和周冉為論文的並列第一作者，四川大學生物治療國家重點實驗室/華西醫院神經內、外科汪源研究員、華西第二醫院/生物治療國家重點實驗室陳路研究員、生物治療國家重點實驗室/國家老年疾病臨床醫學研究中心張燕研究員為論文的共同通訊作者。
汪源研究員團隊歡迎對腫瘤生物學、幹細胞生物學、神經生物學和生物信息學感興趣或有相關背景的助理研究員、博士後和研究生加入，有意者可聯繫wangyuan@scu.edu.cn。
專家點評
劉衝（浙江大學腦科學與腦醫學系研究員）
高級別膠質瘤作為中樞神經系統最為常見的惡性腫瘤，預後差，臨床上目前沒有有效的治療手段。針對膠質瘤治療的挑戰主要來自於其高度的腫瘤異質性與複雜的腫瘤細胞構成。而對於這一複雜的腫瘤構成是如何形成與演化的，目前仍不十分清楚。領域裡近年來逐漸認識到，對高級別膠質瘤的治療需要認識其發病機制和演化規律，這對於膠質瘤的早診早治至關重要。
腫瘤的細胞起源研究是揭示腫瘤發病機制的重要方面。由於腫瘤發生的過程涉及到正常細胞在內源環境中的細胞行為變化及其與周圍微環境的複雜互作，因此目前該類科學問題主要使用基因工程小鼠模型進行研究。然而，儘管動物模型具有完全模擬腫瘤發生的過程的無與倫比的優勢，種屬之間的差異導致其無法完全重現人源細胞的體內癌變過程。另一方面，儘管基於人多能幹細胞（hES）和誘導性全能幹細胞（iPS）分化的體外類器官腫瘤模型可以部分模擬在體外狀態下腫瘤的發生，但這類模型缺少體內複雜的免疫等環境，因此其無法完全重現體內腫瘤的病理特徵。
在這一期的Cell Research上，汪源課題組聯合陳路、張燕課題組成功發展了基於小鼠和人源ES細胞分化的神經幹細胞（NSC）作為細胞起源的「嵌合體」人膠質瘤發生的體內模型，並針對TP53/NF1和TP53/NF1/PTEN作為驅動突變的膠質瘤的演化路徑進行了解析。這一工作是首次在體內環境下模擬並追蹤突變人源NSC癌變的過程，對於膠質瘤致病機制的研究具有重要意義。該系統具有很強的擴展性，一方面可以用於產生不同突變類型的NSC以模擬各種突變產生膠質瘤的過程，另一方面可以通過改造受體小鼠（如使用人源化免疫缺陷小鼠）進一步研究腫瘤細胞與特殊免疫互作等重要問題。總體來說，該工作拓展了現有膠質瘤發生的模型工具，具有廣泛的應用前景。
專家點評
王曉群（中科院生物物理所研究員）
此研究使用了很多精巧的發育生物學分析工具和實驗手段，從類似發育的視角去審視惡性膠質瘤的發生，提出了重要的問題。比如在皮層神經發育過程中神經幹細胞也發生了多次命運轉變，其調控機制與神經幹細胞癌化過程中的命運決定機制有何異同？神經幹細胞在癌化過程中與成體腦內微環境細胞如何互作？這些問題都值得進一步探討，而該工作建立的模型為探究這些問題提供了很好的基礎。
原文連結：
https://doi.org/10.1038/s41422-020-00451-z
參考文獻
1.Wang, Y., et al., Expression of mutant p53 proteins implicates a lineage relationship between neural stem cells and malignant astrocytic glioma in a murine model. Cancer Cell, 2009. 15(6): p. 514-26.
2.Alcantara Llaguno, S., et al., Malignant astrocytomas originate from neural stem/progenitor cells in a somatic tumor suppressor mouse model. Cancer Cell, 2009. 15(1): p. 45-56.
3.Liu, C., et al., Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell, 2011. 146(2): p. 209-21.
4.Fan, X., Y. Xiong, and Y. Wang, A reignited debate over the cell(s) of origin for glioblastoma and its clinical implications. Front Med, 2019. 13(5): p. 531-539.
5.Lee, J.H., et al., Human glioblastoma arises from subventricular zone cells with low-level driver mutations. Nature, 2018. 560(7717): p. 243-247.
6.Zhong, S., et al., Decoding the development of the human hippocampus. Nature, 2020. 577(7791): p. 531-536.
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原標題：《【學術前沿】專家點評Cell Research | 汪源/陳路/張燕組揭示惡性膠質瘤發生路徑和潛在早期診療時間窗口》
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