作者：陳發明，高麗娜，陳芳，第四軍醫大學口腔醫院牙周科
牙周炎發病率極高，危害極大，是導致成年人牙齒缺失的最主要原因，嚴重影響人類的生活質量。不僅如此，牙周炎與全身多種疾病具有相關性，已經證實牙周炎是糖尿病的第六併發症。控制牙周疾病發展、修復牙周組織缺損是牙周病臨床治療的最終目標。然而，傳統牙周炎治療聚焦炎症控制，阻止或延緩疾病進程，難以獲得滿意的牙周組織再生。由此可見，尋求有效、穩定的牙周組織再生技術具有重要的臨床意義。
目前臨床常用的牙周組織再生技術包括引導組織再生術（guided tissue regeneration，GTR）、植骨術、生長因子的應用等。這些再生方法單獨或聯合應用，大大豐富了牙周缺損修復手段、提高了牙周病治療的臨床效果。但是，這些技術仍存在一定的局限性，如可預期性差、適應證有限等。實際上，目前的再生技術主要應用於窄而深的骨下袋缺損，當牙周缺損較大時，往往無法獲得滿意的牙周組織再生。隨著研究的進一步深入，幹細胞移植、內源性再生等策略有望成為未來牙周病損組織再生的重要方法，為牙周生理性、功能性重建提供了新的機遇。本文對牙周組織再生的基礎研究和臨床應用現狀做一簡要回顧，並對該領域的發展前景和挑戰進行展望。
1. 傳統牙周治療
牙周炎是一種慢性感染性疾病，菌斑是其始動因子。因此，傳統的牙周治療以去除菌斑、控制感染為主要目的，主要技術包括齦上潔治術、齦下刮治術和根面平整術及牙周翻瓣術等。隨著新器械、新設備的湧現（口腔顯微內窺鏡、Vector 治療儀、雷射、齦下噴砂機、光動力儀等），牙周治療朝著可視化、精細化、微創化的方向發展，既提高了菌斑的清除效果、縮短了治療時間，又減少了治療過程中產生的疼痛、不適及繼發損傷。可以說，目前的牙周傳統治療質量和效果，已經可以滿足絕大多數牙周炎患者的治療需求，達到延緩或阻止疾病進一步發展的目的。但是，對於已經造成牙周缺損的牙周炎患者，傳統牙周治療後無法獲得缺損組織理想的修復和再生。
2. 牙周再生治療
為進一步提升牙周炎治療效果，特別是一些骨下袋牙周缺損患者，在菌斑控制的基礎上獲得牙周缺損組織的再生，是治療所希望達到的理想目標。實現牙周組織再生，可以徹底消除骨下袋及其所帶來的再感染風險，重建牙周組織對患牙的支撐功能，意義重大、影響深遠。第一代牙周組織再生技術起源於上世紀八十年代末、九十年代初，以GTR技術引入牙周炎治療為標誌，後來伴隨多種骨材料的問世，GTR 與植骨術聯合應用已經成為目前常用的臨床再生治療方法；第二代牙周組織再生技術是伴隨著蛋白工程等生長因子重組技術的發展而建立起來的，以生長因子的臨床應用為主要手段（其中也包含自體來源的內源性生長因子的應用）；第三代牙周組織再生技術是基於組織工程、幹細胞治療的再生新策略，通過進一步基礎和臨床轉化研究，有望獲得高效、可預期的牙周組織再生。
2.1 第一代牙周組織再生技術
2.1.1 引導組織再生
GTR 技術是指在牙周手術中利用膜性材料作為屏障，阻擋牙齦上皮在癒合過程中沿根面生長，避免牙齦結締組織與根面接觸，同時提供一定的空間，引導具有形成新附著能力的牙周膜細胞優先佔據根面，從而在已暴露於牙周袋內的根面上形成新的牙骨質，並有牙周膜纖維埋入，形成牙周組織的再生，即形成新附著性癒合。因此，屏障膜的選擇是該技術的關鍵因素。屏障膜包括不可吸收膜和可吸收膜兩大類。不可吸收膜主要以聚四氟乙烯為代表，具有良好的生物相容性和力學性能，臨床中可單獨使用。由於需要二次手術取出，不可吸收膜臨床應用僅局限於一些特定的病例。
可吸收膜以膠原膜為代表（如Bio-Gide 等），具有良好的生物相容性，表面利於細胞生長、參與組織修復。但可吸收膜力學性能差，往往需要與植骨材料聯合使用，主要適用於垂直型骨缺損（Ⅱ壁或Ⅲ壁）、根分叉病變和個別牙根面裸露的治療，也可用於種植術所需的牙槽嵴增高等。雖然GTR 聯合植骨術已經成為臨床牙周治療中針對上述情況的常用方法，且臨床效果比單純翻瓣術好，但也有研究表明，GTR 聯合植骨術，並不一定可以獲得比單純植骨術更好的臨床效果。因此，牙周植骨術是否一定需要聯合GTR，有待進一步臨床試驗研究去證實。
2.1.2 植骨材料的研究和應用
牙周植骨術是採用骨或骨組織替代品等移植材料來修復因牙周病造成的牙槽骨缺失的一種方法。目的在於通過移植材料促進新骨形成，修復骨缺損，恢復牙槽骨的解剖形態，從而達到理想的骨再生和新附著性癒合。理想的牙周植骨材料應具有良好的生物相容性、生物安全性、生物活性（骨誘導）及生物力學性能等特性。研究表明，不同來源植骨材料在修復牙周垂直型骨缺損時其癒合方式不盡相同。自體骨、異體骨、異種骨移植後常見癒合方式包括：完全牙周組織再生，部分牙周組織再生伴長結合上皮形成，完全的長結合上皮形成。骨替代品移植後未觀察到完全的牙周組織再生，僅有部分牙周組織再生伴長結合上皮形成或完全的長結合上皮癒合，骨替代移植材料常常被纖維組織包裹。不同癒合方式的出現可能與植骨材料的顆粒大小、吸收率、牙齦生物型等因素有關。
Bio-Oss®是一種天然的具有骨引導作用的多孔的骨移植材料，它有助於牙周和頜骨缺損處的骨生長。它是通過特殊工藝加工，將所有的有機成分從牛的松質骨中徹底去除，而精細的骨小梁結構和內部空隙被保存下來，為成骨細胞的長入提供了支架，並保證了凝血塊的穩定和血管的再生。Bio-Oss®聯合Bio-Gide®為目前臨床較常用的再生方式。Bio-Oss Collagen 是在Bio-Oss®骨粉的基礎上加入豬膠原蛋白製成的，它較Bio-Oss®操作簡便、穩定性好、適應範圍更廣，因此，在臨床中也得到廣泛應用。植骨材料在口腔臨床中不僅用於治療牙周垂直性骨缺損（Ⅱ壁或Ⅲ壁骨下袋）、根分叉病變，而且還用於種植術所需的骨增量和頜面外科中。隨著蛋白工程等生長因子重組技術的發展，在植骨材料中複合生長因子來誘導骨形成，有望加速骨的癒合，增強骨的修復能力，從而提高臨床治療效果。
2.2 第二代牙周組織再生技術
2.2.1 重組人生長因子的應用
生長因子是一類生物活性因子，能夠與靶細胞上的相應受體結合，調控細胞的增殖、分化、代謝、免疫應答等。目前發現與牙周組織再生密切相關的生長因子有成纖維生長因子2（fibroblast growth factor-2，FGF-2）、血小板源性生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）、生長分化因子5（growth differentiation factor-5，GDF-5）、骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）等。這些生長因子在許多動物實驗及臨床試驗中已被證實能夠促進牙周組織再生。
值得注意的是，目前重組人生長因子的臨床使用方法仍不明確，如：一種重組人生長因子是否可以同時促進牙周軟硬組織生成、不同患者群體是否需要使用不同的生長因子等。有學者採用Meta分析，評估了rhFGF-2和rhPDGF-BB 的治療效果，結果表明，0.3% 的rhFGF-2 和0.3 mg/mL 的rhP-DGF-BB 顯示出最強的牙周組織再生能力，但在單純牙齦退縮的病例中，應用rhPDGF-BB 並未展現出明顯優勢。因此，大量的基礎研究和臨床試驗仍在進一步推進中。
BMPs在骨改建中起著重要的作用，它可以誘導基質礦化和骨形成。BMP-2和BMP-7是BMP 家族中研究最多的。其中，rhBMP-2是目前唯一通過測試並被FDA 批准作為一種可選擇的骨引導骨移植材料。與其它材料相比，rhBMP-2 具有更多的一級臨床證據。另外，重組生長因子在骨缺損區發揮作用需要維持一定的濃度，因此，選擇合適的載體尤為重要。常用的載體有：膠原海綿、明膠、纖維蛋白、各種植骨材料等。未來的研究將著眼於設計具有緩釋/控釋功能的載體系統來有序的、可控的釋放生長因子，從而更有效的促進牙周組織再生。
2.2.2 釉基質蛋白衍生物的應用
Emdogain 是通過乙酸法、純化層析法從豬恆牙胚提取獲得一種生物活性材料，其主要成分是釉基質蛋白衍生物（enamel matrix derivative，EMD）。在過去二十年的研究中，釉基質蛋白衍生物顯示出良好的牙周缺損修復效果，不僅能促進無細胞性牙骨質再生，促進牙周膜細胞的增殖和分化，而且能夠在組織學上呈現出真正的牙周組織再生。臨床應用中，無論單獨使用釉基質蛋白衍生物，還是釉基質蛋白衍生物聯合GTR 或植骨材料都可以有效促進牙周組織再生，但值得注意的是，釉基質蛋白衍生物在有些研究中並未展現出明顯優勢，其原因可能與試驗中組織缺損高度的異質性、植骨材料的特性、外科手術是否微創等因素有關。因此，大規模、多中心的臨床試驗還需進一步開展。
釉基質蛋白衍生物目前在臨床上主要應用於垂直骨缺損、根分叉病變、牙齦退縮等的修復治療。釉基質蛋白衍生物如何解決水平骨缺損、種植體周圍炎、種植體周圍牙齦退縮等問題在未來將會被進一步深入研究。
2.2.3 血小板濃縮提取製品的應用
血小板濃縮提取製品是患者自體外周血製備的材料。富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）是第一代血小板濃縮提取製品，其在採血和製備時需加入外源性添加劑，故其生物安全性欠佳。富血小板纖維蛋白（platelet rich fibrin，PRF）作為第二代血小板濃縮提取製品，其製備技術簡化、無需添加外源性製劑，具有更好的生物安全性。
濃縮生長因子（concentrate growth factors，CGF）是新一代的血小板濃縮提取製品，它延續了富血小板纖維蛋白的安全性，形成了更多、更緻密的纖維團塊。由於CD34陽性細胞的存在，CGF 還有利於血管的形成。PRF 和CGF 與PRP 相比，富含更多的生長因子。血小板濃縮提取製品由於具有操作簡單、成本低、良好的生物安全性等特點，因此已被廣泛應用於臨床治療如：牙周缺損再生、拔牙窩位點保存、牙槽嵴增量、上頜竇提升、牙齦退縮等。PRP、PRF、CGF 在臨床應用中既可單獨使用，也可與骨移植材料聯合使用提高其活性，還可以製備成膜片用於誘導組織再生。
研究表明，將PRP、PRF 應用於Ⅱ度根分叉病變、垂直型骨缺損治療中，術後探診深度、附著喪失水平、牙槽骨的再生量均得到改善。CGF 在牙周再生中的應用研究剛剛起步。Qiao 等設計隨機臨床對照試驗，觀察CGF治療牙周骨下袋的臨床效果，試驗分為2組，其中試驗組CGF聯合牛多孔骨礦物質（bovine porous bone mineral，BPBM）植入骨缺損區，對照組僅植入BPBM 骨粉。術後1年，從探診深度的下降、附著水平的升高以及骨缺損區硬組織的充填情況三方面評估，兩組相對於基線都有明顯的好轉，CGF聯合BPBM組探診深度的降低和附著水平的提高上明顯高於BPBM 組，且有統計學意義。CGF聯合BPBM組雖然有更好的骨充填結果，但與BPBM 組相比，無明顯差異。為了更好地了解CGF在臨床上對牙周組織再生的影響，還需大量的臨床摸索。
2.3 第三代牙周組織再生技術
2.3.1 幹細胞與牙周組織再生
引導組織再生術、植骨術、生長因子的應用等雖然可以促進牙周組織再生，但其可預期性差，且具有一定的局限性，當牙周缺損較大時，牙周組織再生受限，原因可能與牙周組織中幹細胞數量減少、剩餘幹細胞功能受損有關。隨著組織工程技術和幹細胞治療技術的發展，通過幹細胞移植促進牙周組織再生，成為新的研究方向。
2.3.1.1 牙周再生相關幹細胞和細胞移植
目前應用於牙齒再生和牙周修復的幹細胞包括：牙髓幹細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）、人脫落乳牙幹細胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED）、根尖牙乳頭幹細胞（stem cells from apical papilla，SCAPs）、牙囊祖細胞（dental follicle progenitor cells，DFCs）、牙周膜幹細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）、口腔上皮幹細胞（dental epithelial stem cells，DESCs）、骨髓間充質幹細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）、脂肪幹細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）、胚胎幹細胞（embryonic stem cells，ESCs）和誘導多功能幹細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）等。
不同的幹細胞對於牙周組織再生的效果也不盡相同，研究表明，牙源性幹細胞優於非牙源性幹細胞，牙髓幹細胞與牙周膜幹細胞效果相當。大量的動物實驗及臨床病例報告表明，利用上述幹細胞移植來修復牙周組織缺損均取得了良好的效果。幹細胞不僅可以促進牙周組織再生，而且還具有免疫調節能力。用同種異體PDLSCs 處理大鼠的骨缺損，術後21天，形成大量的骨充填，並且產生與牙骨質和牙周膜相似的結構。將自體和異體PDLSCs 移植到手術建立的小型豬牙周缺損區，結果顯示兩種PDLSCs 均能夠再生出牙周組織。
把異體PDLSCs置於膠原支架中移植到羊體內建造的牙周缺損模型中，治療後4周觀察到新的牙槽骨形成。觀察異體來源的SHED 修復小型豬中建立的牙周缺損，結果發現SHED可有效修復牙周炎引起的硬組織和軟組織的缺失，且無不良影響。研究表明，這些細胞具有低免疫原性和明顯的免疫抑制作用，一方面是通過分泌前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2），導致PGE2 誘導的T 細胞失去效能；另一方面，通過程序化細胞凋亡蛋白1和程序化細胞凋亡蛋白配體1結合，使得細胞-細胞發生接觸，抑制B細胞激活。
幹細胞促進組織再生依賴於能夠準確到達病損處發揮功能，因此，細胞移植方式至關重要。細胞的移植方式主要分為支架承載型和無支架型。支架承載型主要為幹細胞結合支架材料，但支架材料的降解過程可能引起局部炎症反應，影響再生微環境使其推廣受限。無支架型包括細胞注射和細胞膜片兩種技術。
細胞注射技術在幹細胞介導組織工程中應用普遍。局部注射DPSCs 或PDLSCs 治療牙周組織缺損，可以有效再生牙周組織。局部注射BMMSCs 懸液於大鼠牙周炎模型上，觀察到牙周組織再生。但由於細胞懸液的流動性，直接注射後細胞容易丟失，導致發揮作用的細胞量很少，因此，細胞注射技術雖然可以有效促進牙周組織再生，但還不能實現牙周組織的完全再生。細胞膜片是通過在維生素C 上培養細胞或者應用溫度反應細胞培養皿培養細胞形成的。細胞膜片能夠保存細胞外基質和細胞之間連接，這些結構可以被蛋白水解酶如胰蛋白酶和/或裂解酶分解掉。
細胞膜片技術在牙周組織缺損修復、眼角膜重建、肝臟再生等多種疾病治療中均顯示出積極的效果。因此，將細胞膜片技術引入到牙周組織工程將是牙周組織再生、重建的一個方向，但細胞膜片容易攣縮，外源性載體可能會干擾組織的代謝及改建，深入探討細胞和細胞外基質的生物學機制以及優化膜片製備的方式，充分保證有效的膜片強度並避免種子細胞的不利分化將是未來研究的重點。
2.3.1.2 幹細胞治療牙周炎的臨床應用研究
將基於幹細胞的牙周治療從動物研究轉移到人體臨床試驗的時代已經到來。應用PDLSCs、BMMSCs和牙齦來源細胞或骨膜來源細胞進行牙周組織再生已經進入臨床試驗階段。目前，一些牙髓和牙周組織再生的臨床試驗已經註冊運行，其中包括兩個牙周組織再生的臨床試驗，一是在35例患者中利用自體PDLSCs 修復牙周骨下壁缺損的研究，主要評價其安全性和有效性（NCT01357785）。二是筆者課題組的一項單中心隨機試驗研究，同樣是關於細胞安全性和有效性的研究（NCT01082822）。該課題組採用自體PDLSCs 與Bio-Oss 骨移植材料治療牙周垂直骨缺損。納入的患者被隨機分配到細胞組（Bio-Oss 複合PDLSCs 細胞膜片+GTR）或對照組（Bio-Oss聯合GTR）。在為期12個月的追蹤研究中，筆者評估了不良事件的發生率及牙槽骨的再生量等指標。
研究結果顯示，PDLSCs 臨床安全性高，患者均無不良反應；每組均顯示牙槽骨高度（骨缺損高度下降）較術前顯著增加（P＜0.001）。然而，在細胞組和對照組之間差異無統計學意義（P > 0.05）。基於幹細胞的牙周治療療效仍需通過多中心、大樣本量、隨機對照研究來進一步驗證。此外，另兩個試驗組正在招募自願者，一組是慢性牙周炎患者接受同種異體人DPSCs 局部注射，觀察其再生牙周組織的能力（NCT02523651）。另一組是評價應用BMMSCs 結合富含纖維蛋白凝膠的膠原支架，修復牙槽骨缺損的安全性和有效性的隨機對照試驗研究（NCT02449005）。
2.3.2 內源性再生技術
幹細胞治療是組織工程和再生醫學領域目前研究的熱點，並日益成為轉化醫學的研究核心。然而，當前巨大的研究投入並未真正惠及更多的臨床患者，絕大多數研究還僅停留在實驗室研究階段，臨床轉化面臨嚴峻的困難和挑戰。這不僅是因為目前幹細胞治療和組織工程技術在治療非致死性疾病中的臨床應用前景飽受爭議，還體現在「風險」、效益評估過程中，無論從社會、醫師還是患者的角度，應用一種高投入、高風險的技術治療目前已有相應替代治療方法（如拔牙後行牙種植術和義齒修復）的疾病時，很難評估其競爭力和生命力。在再生牙科學研究領域，內源性再生策略將為目前處於困境的牙髓、牙周組織再生帶來一種全新的治療理念。
利用生物技術募集機體內源性幹細胞作為牙周組織再生的「工具」，稱為「牙周內源性再生」。所謂「內源性」僅針對細胞來源而言，並不排除其它治療幹預措施。內源性再生策略避開了組織工程中涉及的複雜過程，減少了時間成本，儘管代表了臨床上最可行的方法，但內源性再生成為患者治療的可靠和有效途徑之前，必須更好地理解和實質性解決三個問題：一是如何使幹細胞找到「回家」的路，主要策略為通過釋放生物活性因子如P物質、基質衍生因子-1a（stromal-derived factor 1a，SDF-1a）、幹細胞因子、粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）和單核細胞趨化蛋白（monocyte chemoattractant proteins，MCPs）等作為信號分子，招募吸引幹細胞「回家」；二是如何將歸巢的幹細胞「留」下來，主要應用仿生生物材料設計模擬細胞再生微環境來留住細胞；三是如何使留下來的幹細胞更好的發揮再生功能，主要方式為通過設計可以激活免疫反應的生物材料來調節免疫應答，從而刺激和增強機體幹細胞自我修復創傷的能力，雖然調節免疫應答對於組織再生至關重要，但使生物材料精確地調控先天免疫和適應性免疫應答的方法仍處於研究的早期階段。
此外，我們還不知道如何在特定的再生環境中控制免疫刺激和免疫抑制之間的平衡。因此，未來研究將致力於開發可以募集細胞、調控細胞的仿生生物材料來促進內源性組織再生。此外，體內追蹤幹細胞運動的研究，以及旨在確定幹細胞「招募」機制的進一步研究，將為生物材料設計領域的研究開闢新的途徑。
3. 前景與展望
長期以來，人們一直尋求一種理想的方法來實現牙周組織的完全再生。但是，無論使用哪種技術或是幾種技術的聯合使用，都存在許多問題亟待解決。提高治療預期性，修復水平骨缺損或複雜骨缺損，加快細胞治療臨床轉化等是今後研究的重點。因此，未來還需要更多的多中心、長期、大樣本量的臨床隨機對照試驗開展來提高牙周組織再生技術的可預期性。
另外，隨著3D 列印技術的發展，有望解決水平骨缺損或複雜骨缺損的難題。而內源性再生技術利用內源性幹細胞歸巢促進組織再生，可以避免細胞培養、細胞儲存等問題，有望加快臨床轉化，但相關的技術研究仍處在基礎研究階段。值的注意的是，牙周組織再生臨床治療效果不能盡如人意，重要原因之一就是人群對疾病的認知不足，忽略菌斑控制的重要性，防病於未然的意識薄弱。所有的牙周組織再生治療結果均離不開患者自身良好的菌斑控制。因此，需要在樹立人群口腔健康意識、加強醫生和患者相互配合、加快醫療體制改革等各方面努力，才能從根本上改善和提高牙周健康狀況，提高臨床治療療效。
來源：陳發明,高麗娜,陳芳.牙周再生治療現狀和進展[J].口腔疾病防治,2019,27(01):9-16.
(本網站所有內容，凡註明來源為「醫脈通」，版權均歸醫脈通所有，未經授權，任何媒體、網站或個人不得轉載，否則將追究法律責任，授權轉載時須註明「來源：醫脈通」。本網註明來源為其他媒體的內容為轉載，轉載僅作觀點分享，版權歸原作者所有，如有侵犯版權，請及時聯繫我們。)