作者：施少傑，丁鋒，宋應亮，第四軍醫大學口腔醫院種植科
臨床上長期缺牙、牙周病及其他原因導致的牙槽嵴骨量不足是口腔種植的一大難題，所以很多情況下需要人為改善種植位點。目前，改善牙槽嵴的方法包括引導骨再生（guided bone regeneration，GBR）、垂直骨劈開術、上頜竇提升術和外置植骨術等。其中GBR是臨床應用時間較長的一種方法，但在缺損較大時成骨效果仍不理想。
隨著組織工程的發展，越來越多的新材料和生物活性分子被試圖用於增強GBR的效果。但是很多研究表明生長因子應用於GBR後，新生骨的長期穩定性不能得到保證，這違背了使用生長因子的初衷。若能找出原因並予以解決，將能大大增強GBR的效果，拓展GBR的應用。為此，文章選取了國內外關於組織工程應用於GBR的文獻，通過分析整合，對二者聯合應用的現狀和發展前景進行闡述，據此對目前生長因子輔助GBR長期穩定性不良的問題提出相關看法。
下一步的研究方向初步擬定為先驗證文中提出的假設，改進生長因子和屏障膜的使用，以期能增強GBR的骨再生效果，若能有穩定的骨量和骨質，則有望將GBR擴展到用於改善口腔以外的骨質，如糖尿病患者及骨質疏鬆患者的骨質不良性缺損，或損傷後較大缺損的修復，使之成為一種全身性組織缺損修復的常態化輔助手段。
1.關於GBR膜的研究
1.1GBR膜的分類和應用
GBR的概念來源於牙周的引導組織再生（guided tissue regeneration，GTR），是用屏障膜將牙周軟組織與缺損隔絕開來以保證缺損處優先成骨。屏障膜分為可吸收與不可吸收兩種：不可吸收的有e-PTFE、鈦網膜等；可吸收的有膠原膜、聚乳酸合成膜等。兩者各有優缺點：不可吸收膜機械性能好，但組織親和性差，需要二次手術取出，患者的痛苦和花費較多；可吸收膜不需要手術取出，但是其機械性能較差，且降解速率難以控制。
應用較多的膜材料有：①不可吸收膜：e-PTFE膜生物相容性好且能保護血凝塊，被視為屏障功能材料的金標準。然而，e-PTFE膜需要二次手術取出，若提前暴露於口腔環境會導致治療的失敗，所以需保證軟組織封閉。②鈦網：可以作為屏障膜單獨使用或用於加強可吸收膠原膜，有良好的生物機械性能。③天然材料：膠原是細胞外基質的主要成分，配合生長因子，可以誘導新骨形成，但是膠原膜在體內的不定期降解會影響成骨效果。④人工合成高分子聚合物：聚乳酸的合成聚合物（PLA）等誘導成骨分化的潛力較強，已經發展成為自然膜的替代。但是聚乳酸膜降解較快，並且聚乳酸水解後的殘餘會引起局部炎症，形成膿腫。⑤脫細胞真皮基質：脫細胞真皮基質是去除自體或異體的皮膚組織中的細胞後保留結構完整的細胞外基質作為屏障膜，促進缺損區域組織再生。
1.2GBR的限制因素
1.2.1GBR技術的相關不足
目前GBR技術的不足在於主要依賴機體自身的生長潛力來修復缺損，幹細胞的活性和數量不足，以致於很難預測成骨效果，在缺損較大和機體情況不佳時無法取得滿意的成骨效果。並且膜在應用中有屏障功能失效的可能性，一是因為軟組織封閉不良導致膜暴露於口腔環境中，二是軟組織封閉良好但可吸收膜降解失去屏障保護功能，這些都是GBR技術應用的限制所在。隨著技術的進步，GBR膜也需要有一些新的發展方向：①提高膜的理化性能來增強屏障功能；②設法提高其成骨能力。
1.2.2GBR膜暴露的研究
GBR需要良好的軟組織封閉和傷口的長期穩定性來保護再生過程。有學者對膜暴露後的成骨效果進行了研究，發現膜不暴露組的水平骨增量比膜暴露組多74%，骨缺損體積減小量多27%。還有研究使用不同孔徑的不可吸收膜進行暴露實驗，孔徑小於細菌一般直徑的膜暴露後也能取得近似於對照組的成骨效果。更進一步地，有研究報導，在膜暴露早期及時進行系統抗菌治療，更換膜並關閉軟組織，可以觀察到與對照組近似的成骨效果。可以看出膜暴露的危害主要來自於細菌侵入，所以在GBR進程中發生膜暴露後及時進行處理可以將消極影響降到最低。
1.2.3可吸收膜的降解規律研究
可吸收膜臨床應用較多，但是其降解規律尚不完全清楚。目前試圖研究膜降解模式的實驗不多，其中較有說服力的是Calciolari等，他們發現膠原膜的完整性可以維持一段時間，然後隨著新生骨和血管的形成以及炎症細胞的作用，屏障膜喪失完整性從而失去屏障保護功能。與現有類似實驗相同的是，研究者太側重於膜降解的物理變化，而忽略了膜降解時新生骨的成長過程。在骨再生早期，膜降解後屏障功能喪失，軟組織侵入會影響成骨效果。
但是，新生骨的生長是一個動態的過程，所以不難想到，在骨再生的過程完全結束之前是否會存在一個時間點或範圍，其後膜降解無法再影響成骨效果。可設置實驗以驗證：通過人為設定拆除不可吸收屏障膜的時間點來模擬體內可吸收膜失去屏障功能的情況，對照屏障膜完好組，找出新生骨成長過程不再被軟組織幹擾的時間點或範圍，以及對應的骨生長參數。
若要採取此種驗證方法，在人為取出不可吸收膜時需要嚴格做好組織管理和系統抗菌處理，按前文的結論，可以儘量降低術區汙染的不可控性，提高實驗成功率，但仍有一定風險。可以肯定的是，要解決屏障膜降解不可控的問題，除了設法改進屏障膜理化性質以延緩降解，還可以設法加速新生骨的生長，使其在可吸收膜失去屏障功能的時間之前達到不被軟組織影響的程度，然而這兩者是否會互相干擾還需要研究驗證。
2.組織工程基礎和應用於GBR的現狀
2.1組織工程應用基礎
組織工程有三要素：幹細胞、生長因子以及攜帶二者的生物支架。組織工程支架提供細胞粘附、生長和周圍組織長入的三維空間結構，由生長因子調控和誘導幹細胞增殖、分化。隨著新生骨組織和血管長入，支架材料逐漸降解，最終達到缺損完全由自體組織充滿的目的。GBR要使用屏障膜和植骨材料，其中自體骨為植骨材料的金標準，但是存在第二手術位點以及一系列的併發症。
由於純粹的骨替代材料修復進程較慢，所以有學者試圖通過組織工程來加快再生，如Thoma等將rhBMP-2載入異種骨材料用以增強GBR，還有Talaat等將骨髓濃縮液和富自體濃縮生長因子應用於下頜骨病變切除後的骨再生，也取得了較好的成骨效果。雖然這些實驗沒能提出定性的作用機制和定量的使用方案和用藥規劃，但是表明組織工程有加強GBR的可能性。
2.2組織工程在GBR中的應用研究進展
2.2.1GBR中生長因子作用的質疑
生長因子對新生骨組織的形成有著重要的調控作用，在誘導新生骨形成的過程中用到的有骨形成蛋白（BMP）、血小板衍生生長因子（PDGF）、血管內皮生長因子（VEGF）等。目前對生長因子應用較多的形式有血小板製劑和rhBMP家族等。按照組織工程的理論，生長因子應該是有利於骨再生的，然而現實不僅限於此。有研究將取自人血小板的生長因子混合物和膠原支架、牙周膜幹細胞分組聯合後輔以膠原膜用來修複種植體周圍骨缺損。實驗發現使用了生長因子的組相比對照組沒能取得理想效果，對此實驗者沒能作出解釋。還有研究發現，使用生長因子的成骨效應前後不一。
有研究者將BMP-2載入聚乙烯乙二醇凝膠（PEG）用來治療種植體周圍缺損，實驗發現生長因子組16周的成骨效果不如第8周，新生骨區域百分比甚至降低一半，組織學觀察發現骨改建尚未完成，有破骨細胞的存在和軟組織的長入。此實驗時間略短，應適當延長實驗觀察期，待實驗組骨改建完畢，確認生長因子對骨再生的作用總和，但由於組織學觀察發現主要是破骨細胞的活動，所以骨量更有可能越來越差。
由於不同生長因子的作用不同，有可能是因為單一一種不足以支持完整的骨再生過程，所以又查閱了多種生長因子聯合使用的文獻。有研究將VEGF和rhBMP-2聯合應用於GBR，發現生長因子組仍然存在長期穩定性不良的現象。還有研究將血小板濃縮物和rhBMP-2用於GBR，發現生長因子組第8周的成骨效果高於陰、陽性對照組，第16周高於陰性對照組，低於陽性對照組。得到類似結果的實驗很多，但是尚未有研究者給出有說服力的解釋。
經過對比發現，這些實驗有一個共性：都使用了生長因子，但成骨的長期穩定性不如未使用生長因子的對照組。所以有理由懷疑新生骨長期穩定性不良與人為加入的生長因子有關。按照內分泌系統的規律推測，可能是最初高濃度的生長因子引發了負反饋機制，抑制了自身生長因子分泌，再加上外源生長因子逐漸消耗而不能支持新生骨的生長和成熟，在後期的生長階段不能滿足成骨所需的生長因子濃度，導致骨吸收發生。可以通過定期注入生長因子來保持缺損處的生長因子水平，觀察成骨結果來驗證猜想。
有研究用攜帶生長因子膜浸潤的上浮液培養成纖維細胞，發現第1個小時的上浮液促細胞有絲分裂能力很高，之後快速下降，雖然此實驗與體內環境不同，但也有一定的參考意義，可以看出的是人工生長因子不能保持恆定水平，需要後期補充，但是補充時間點尚未能明確，一方面是目前沒有定量檢測人工生長因子在體內濃度變化的方法；另一方面尚不清楚需要在生長因子水平降低到何種程度時進行補充。所以只能人為界定濃度與時間梯度進行探索，這都需要進一步研究。
但進一步的研究仍有困難，主要在於體內環境的特殊性，一方面關於生長因子在體內局部停留時間的研究較少，而體外實驗又很難模擬體內環境，體外實驗得到的生長因子清除速率與體內不同；再有就是在體內不同濃度的生長因子在不同時期的成骨效果如何不得而知。若假設成立，則表明需要後期持續的人工生長因子供應，可以通過更改膜攜帶生長因子的濃度來建立濃度檔次與成骨效果對應關係的資料庫，通過建模型來推測合理的長期用藥規劃。
2.2.2組織工程支架用於GBR的研究觀察
組織工程支架為新生的骨組織和血管提供生長和延伸的空間，但是由於骨缺損的形狀往往很複雜，要充滿缺損處較為困難。新近興起的聚乙二醇（PEG）靈活易於處理，是一種很理想的支架材料。有研究將PEG代替膠原膜用於GBR，結果發現實驗組也出現了新生骨長期穩定性不良的問題，但是實驗組新骨區域減少的百分比小於使用了生長因子的實驗（用百分比可以更客觀地比較不同實驗的效果）。
凝膠組沒有使用屏障膜，其屏障功能難以得到保證，所以新生骨的長期穩定性不良可能不僅僅與生長因子有關，還可能與屏障功能有關。有研究者嘗試將顆粒狀骨替代材料和切碎的L-PRF膜一起用纖維蛋白液混合植入缺損處，覆以膠原膜加一層L-PRF膜，觀察5到8個月後發現水平骨增量較好且無明顯的長期穩定性不良現象。與之前類似的實驗對比可發現此實驗中應用了兩層膜，然後得出了比一層膜更理想的成骨效果，所以更有理由懷疑新生骨穩定性是否與屏障膜有關。
還有實驗從分子水平證實了這種現象，有研究將L-PRF膜用於兔子脛骨缺損的復原，第14天出現骨生長相關分子表達降低的現象，而且在第14天時膜出現了不完全的吸收，也可以看出成骨過程與膜的完整性有關。之前文中提到有關於膜體外降解規律的研究，可以研究使用了生長因子後膜的體外降解規律，看是否是生長因子改變了膜的降解規律。若與此無關，則可能是體內因素：生長因子在加速骨生長的同時，誘導新生血管形成和炎性細胞趨化等作用，從而促進了膜的降解，使膜在新生骨成熟之前就失去了完整的屏障功能，導致軟組織長入，幹擾新生骨生長，引起骨吸收，出現了觀察到的新生骨長期穩定性不良的現象。
目前關於生長因子的實驗使用的大多是可吸收膜，所以對於這種可能性，可以將不可吸收膜用於生長因子的GBR過程，來判定是否與膜和屏障材料的完整性有關，若證明有關，則應設法加強屏障功能。
2.2.3組織工程改性膜的發展
組織工程可以將生長因子載入屏障膜中，有研究發現將rhBMP-9載入膠原膜中可以取得比載入骨替代材料更好的成骨效果，另外有研究表明肝素化處理生物膜後有助於控制生長因子的攜帶和釋放。雖然仍有膜加速降解的風險，但若能在膜降解之前誘導新生骨更快的成熟，也可以達到目的。但是研究者們未提到的一種可能性是，膜作為生長因子載體是否有促進屏障膜附近的骨比深處骨更快生成，起到加固屏障的作用。有研究發現將脫細胞基質生物礦化可以使其化學組成近似於自然骨，提高其成骨能力。
有研究者將透明質酸（HA）加入膠原中發現其降解率被大大降低，另外有研究將硅藻土加入殼聚糖複合膜中發現膜具有非常好的物理、化學和生物性能。在膜中加入無機填料可以改善其物理性能，延緩降解，這可以作為解決膜降解問題的新思路。除了設法改進膜的性能外，還可以使用雙層膜來增強屏障功能，既允許營養交換，又可以隔絕軟組織。
總的來說，要將組織工程和GBR更好地聯合起來，既要設法增強其再生效果，還要考慮對膜性能的影響，以及對機體的後續作用。
3.前景及展望
文中討論了生長因子對機體的作用和對膜的作用，發現要解決成骨的長期穩定性問題，一是要加快成骨速度；二是設法延長膜的功能時間。這二者之間很可能存在矛盾性，即採取措施加快成骨的同時會可能會無意間加速膜的降解。所以無論生長因子作用如何，增強膜性能都是必要的。通過改進膜的理化性質來增強其抗降解能力與抗菌能力，還可以配合凝膠材料充填缺損和應用雙層膜來延長屏障膜的功能時間。對於生長因子水平不足的問題，則可以通過後期更換攜帶生長因子的外層膜或直接注入生長因子來保證供應量充足。
屏障功能和生長因子功能得以保證後，種植體周圍缺損的修復乃至牙周病學中GTR的療效都有可能被加強。但是這些都需要後期研究的支持，所以進一步的研究將把重點放在提高組織工程和GBR新生骨穩定性上，找出生長因子的用藥規劃，設計出更理想的改性屏障膜方案，若能取得快速、穩定的成骨效果，將不止限於口腔內種植體周圍骨組織缺損修復，甚至可以用於改善糖尿病及骨質疏鬆缺損、修復外傷造成的缺損等。
來源：施少傑,丁鋒,宋應亮.GBR技術引導頜骨再生的研究進展[J].口腔醫學,2019(03):261-265.
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