作者：王瑾，張月，劉克達，王蔚，中國醫科大學口腔醫學院·附屬口腔醫院
由創傷、感染、先天畸形、腫瘤等原因引起的口腔頜面部軟硬組織缺損，不但影響患者的咀嚼、發音等功能，而且不利於美觀，嚴重影響其身心健康。學者們嘗試自體骨及多種骨替代材料修復缺損部位，自體骨移植常受供區尺寸限制，伴發疼痛、感染、神經損傷等併發症；而單一骨替代材料則普遍存在塑形性差、成骨速度慢等缺點。
骨組織工程和再生醫學通過將幹細胞或生長因子加載到支架材料上，使頜面部缺損重建成為可能。濃縮生長因子（concentrated growth factor，CGF）是最新一代血小板濃縮物，含有多種自體骨誘導性生長因子，單獨應用或聯合其他骨移植材料已廣泛應用於修復口腔頜面部軟硬組織缺損。幹細胞是具有自我複製能力的多潛能細胞，特定條件下可分化為多種功能細胞，是再生醫學的核心組成部分。
CGF可誘導幹細胞增殖並分化為成骨細胞，進而激活成骨細胞並增強血管生成，引導新骨形成。基於此，學者們認為應用CGF聯合幹細胞療法在口腔頜面部缺損修復領域具有廣泛的應用前景。
1.CGF發展歷史
目前，自體血小板濃縮物已發展至第三代。富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）是採用雙重離心技術從自體全血中提取的第一代血小板濃縮物，含有豐富的生長因子；但PRP製備過程繁瑣，需添加外源性凝血酶才可釋放生長因子，且生長因子作用時間短暫。富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）是採用單次離心法從自體全血中提取的第二代血小板濃縮物，製備方法簡單，無需添加凝血酶即可釋放生長因子且生長因子持續時間更長。
CGF是專用離心機（Medifuge，Silfradentsrl，義大利）以2400~3000r/min的轉速交替變化離心自體靜脈血製備出的第三代血小板濃縮物，不但保留了PRF的優點，而且能夠分離出比PRP和PRF更大、更密集的纖維蛋白基質；CGF植入缺損部位後不會迅速溶解，而是以類似於天然血凝塊的方式進行緩慢重塑，因此，生長因子作用時間延長。此外，CGF較之PRP和PRF具有較高的強度和黏度，可更好地保護生長因子免於蛋白水解。
2.CGF主要成分及作用
CGF主要成分為多種生長因子、CD34陽性細胞、血小板、白細胞及纖維蛋白原所形成的纖維網狀支架。CGF包含多種已知對骨骼再生至關重要的生長因子，如血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）和成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）。
PDGF是高效的促有絲分裂因子、多種細胞的強效吸引劑，能夠維持新生血管的穩定性，促進幹細胞的成骨分化，被認為是組織修復與再生的關鍵調節因子。TGF-β是一種分泌蛋白，具有良好的生物活性和多種調節功能，能夠激活軟骨形成及幹細胞成骨分化，在骨癒合過程的早期和中期起關鍵作用。
TGF-β1是TGF-β最豐富的亞型，其主要功能是促進前體成骨細胞趨化並促進纖維細胞分泌纖維黏蛋白和膠原蛋白，調節骨細胞生長、免疫和分化。VEGF作為血管活性分子，是細胞外基質重塑和血管生成的重要協調者，參與初始血管舒張，增強血管內皮細胞通透性，重建血管周圍基質，誘導內皮細胞的增殖和遷移等過程。
IGF由骨細胞產生，是生理性骨折癒合和成骨細胞成熟的重要標誌，在骨基質的生長、分化和代謝過程中發揮關鍵作用。FGF在特定條件下起成骨促進劑的作用，其中FGF2和FGF9能夠誘導成骨細胞的增殖及血管生成，FGF18可促進成骨細胞分化。這些生長因子在發揮自身功能的同時也具有協同作用，並建立了緊密接觸的組織修復調節系統，促進軟硬組織再生。
CGF中含有大量CD34陽性細胞，在維持血管形態、促進新血管生成中發揮重要作用。CGF中捕獲的血小板和白細胞能夠釋放趨化因子，從而促進細胞募集。CGF具有纖維蛋白基質形成的三維支架結構，富有彈性和滲透性，可作為生長因子的儲庫，這種緻密的纖維蛋白網絡不僅為細胞的黏附與遷移提供了基質表面，而且保護了活性分子免於蛋白水解。
3.CGF在口腔頜面部缺損修復領域對幹細胞增殖及成骨分化的作用
3.1CGF在牙周膜幹細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）增殖及成骨分化過程中的作用
2004年，Seo教授首次分離出PDLSCs，是牙周組織再生最直接可靠的種子細胞，具有多向分化潛能且易於分離純化，但短期內很難獲得充足牙周組織再生所需的細胞量，PDLSCs經過多次傳代後難以誘導分化，因此如何高效擴增PDLSCs成為研究熱點。Yu等將CGF與PDLSCs共培養發現，CGF能顯著促進PDLSCs增殖，上調鹼性磷酸酶活性、礦化結節數量及特定蛋白的表達量，而且以劑量依賴性和時間依賴性方式促進了PDLSCs活化及分化。
賈婷婷將PDLSCs分別接種於CGF膜、海奧膜及空白孔板表面，3~5d後CGF膜表面細胞數量遠高於海奧膜及空白對照組；對3組細胞成骨誘導7d後，CGF膜組的成骨相關mRNA及成骨相關蛋白表達量高於海奧膜及空白對照組，提示CGF與成骨誘導條件聯合應用時可顯著促進PDLSCs成骨分化。骨穩態從根本上受Wnt信號通路調控，Qiao等發現CGF處理的PDLSCs中Wnt3amRNA表達隨時間增加，表明Wnt/β-catenin信號通路參與了CGF誘導PDLSCs早期增殖和分化過程。
3.2CGF在牙髓幹細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）增殖及成骨分化過程中的作用
牙髓是疏鬆的結締組織，具有一定修復與再生能力，輕微的炎症可刺激留存於牙髓中的DPSCs遷移至損傷部位，繼而分化為成牙本質細胞並參與修復牙本質-牙髓複合體。因此，如何在炎性微環境下促進牙髓組織再生成為研究熱點。Xu等將DPSCs分別與CGF、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）及CGF+LPS共培養，3d後CGF+LPS組的增殖、遷移細胞數量顯著高於CGF組和LPS組，7d後CGF+LPS組hDPSCs的鹼性磷酸酶活性增加，21d後CGF+LPS組礦化結節數量和成骨相關基因的表達顯著高於其他兩組。同時進行的動物實驗發現CGF可促進比格犬未成熟牙齒的牙本質-牙髓複合體的再生，初步認為CGF可能是牙髓再生治療中的替代生物材料。
杜楠進而證實CGF促進DPSCs成牙、成骨分化在一定範圍內呈現濃度依賴性。Jin等通過掃描電鏡觀察到CGF的多孔纖維蛋白網絡結構，體外實驗研究發現，高濃度CGF刺激細胞增殖，而低濃度CGF促進DPSCs介導的牙本質生成和血管生成過程。
3.3CGF在人骨髓間充質幹細胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）增殖及成骨分化過程中的作用
BMSCs是能夠分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等的多能細胞，常作為骨組織工程的種子細胞。Honda等率先進行了大鼠顱骨缺損的骨組織再生實驗，CGF與BMSCs聯合治療法在術後12周完全修復骨缺損部位，在體外研究中，CGF以劑量依賴性的方式促進BMSCs的增殖及成骨分化。進而，Chen等證實CGF聯合BMSCs在骨缺損修復中的獨特優勢，CT和組織學證實術後6周骨缺損的周圍及中心均出現了新生骨，並發現CGF聯合BMSCs在刺激血管生成方面也優於膠原蛋白。
狄婧研究發現，CGF能明顯促進BMSCs的早期增殖，加強成骨誘導培養基的成骨誘導能力。柳逸博等研究發現，CGF聯合1，25二羥基維生素D3的應用亦可促進大鼠BMSCs的增殖，並促進其成骨分化。以上研究結果表明，CGF與BMSCs的聯合應用具有骨組織工程的必要特徵（骨生成細胞——BMSCs、骨誘導支架——纖維蛋白基質、骨傳導性生長因子——血小板生長因子），CGF不僅為BMSCs提供了三維纖維蛋白支架結構，而且釋放多種生長因子，這些因子通過特定的受體調節BMSCs的增殖及成骨分化。
3.4CGF在脂肪幹細胞（adipose-derived pulp stem cells，ADSCs）增殖及成骨分化過程中的作用
ADSCs存在於脂肪組織，於2001年被發現具有類似於BMSCs的生物學特性及成骨分化性能，且ADSCs具有來源廣泛、易於分離培養、再生性能強等優勢。王超等將CGF與ADSCs置於凝膠海綿表面用於修復大鼠全層皮膚缺損，結果表明，添加CGF與ADSCs的凝膠海綿組創口癒合時間顯著短於單純海綿組及單純包紮組，且炎症反應較輕。
馬翔宇等進一步探討CGF對ADSCs成骨作用影響，將CGF與ADSCs體外共培養，實驗組成骨指標表達量均顯著高於對照組，證實CGF可明顯促進ADSCs體外增殖及骨向分化。
4.總結與展望
CGF取材於自體靜脈血，來源廣泛，製備方法簡單，全過程無任何添加，避免傳染性和過敏性疾病的發生，並且CGF富含組織癒合所需的多種生長因子，具有柔軟、纖薄、有彈性的纖維蛋白網格結構，被認為是良好的自體生物材料，表現出高效促進軟硬組織再生修復的能力，在口腔臨床醫學領域的應用越來越廣泛。
修復口腔頜面部組織缺損是臨床較難解決的問題之一，骨組織工程是修復組織缺損的重要手段，理想的種子細胞則是骨組織工程的必要條件。成體幹細胞能夠自我更新並具有一定多向分化潛能，特定條件下，幹細胞可分化為功能細胞，參與組織修復過程。幹細胞及生物材料的組合在口腔頜面部缺損修復領域的研究與應用取得了飛速發展。鑑於CGF的獨特自身優勢，學者們探索了CGF對幹細胞分化特性的作用，證實CGF可促進多種幹細胞增殖及成骨分化，認為兩者的聯合應用可作為修復口腔頜面部缺損的新型治療方式。
CGF與幹細胞聯合療法的開展面臨以下問題：CGF中各生長因子的具體比例、促進組織再生的分子生物學機制尚不清楚；CGF與幹細胞聯合應用的研究目前主要局限於體外研究，缺乏大量動物實驗輔證，其遠期應用效果也缺乏追蹤報導。鑑於CGF的獨特自身優勢，需開展更為深入的研究，以加快CGF與幹細胞聯合療法在口腔頜面部缺損修復領域及其他醫學領域的應用。
來源：王瑾,張月,劉克達,王蔚.應用濃縮生長因子促進幹細胞增殖及成骨分化修復口腔頜面部缺損的研究進展[J].中國實用口腔科雜誌,2020,13(01):47-50+54.
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