撰文 | 岷眉
責編 | 酶美
生物機體在自然界面臨著各種壓力和應激狀況，演化出一系列複雜精密的感受能量狀態變化調節自身代謝的分子機器。mTORC1複合體是細胞合成代謝的調控中心，生長因子，葡萄糖和胺基酸水平的改變都能影響mTORC1複合物的活性，進而控制下遊底物激活和細胞生長。其中GATOR-Rag路徑和FNIP-FLCN-Rag路徑感知細胞胺基酸水平的變化來控制mTORC1的激活。胺基酸可來源於細胞外通過膜上的胺基酸轉運蛋白直接輸入；也可經由巨胞飲經內吞途徑轉運到溶酶體降解獲得。溶酶體膜表面則是mTORC1複合物激活行使其功能之地。在已有的技術條件下，胺基酸感受的主要路線似乎已知曉，但其中很多問題尚未明了。
近端標記是近年發展起來特異蛋白質標記技術手段，主要有APEX、BioID和turboID三種方法。目標蛋白插入進行生物素化的亞基，可對與之相關的附近的蛋白質進行標記富集，通過質譜分析，獲得蛋白質特殊時空分布和互作的信息。採用新的技術對現有生物學過程和目標蛋白進行探索，將提供更多更新的信息。
近日，Science刊發了來自加拿大多倫多大學Anne-Claude Gingras實驗室的研究成果：The GATOR–Rag GTPase pathway inhibits mTORC1 activation by lysosome-derived amino acids。作者採用了BioID的方法鑑定比較了內吞運輸途徑不同目標囊泡上的蛋白質，揭示了不同來源的胺基酸對mTORC1的調控機制差異。
SNARE（SNAP Receptor）蛋白負責各種囊泡之間，囊泡與質膜之間的融合。SNARE蛋白的差別決定了融合膜系統的特異性。VAMP7和VAMP8屬於R-SNARE蛋白，分別負責了內吞體與溶酶體，內吞體與質膜的融合過程。作者將BirA生物素化蛋白分別插入VAMP7和8位點，以鑑別不同性質囊泡融合過程所需蛋白差異。同時，還進行突變VAMP7的BioID實驗為負對照。三組BioID獲得的蛋白組進行了比較鑑定，雖然VAMP7和VAMP8獲得的蛋白有很大部分重合，實驗仍然富集了各自特異的相關功能蛋白組。
VAMP7經由AP-3複合物轉運至將與溶酶體融合的囊泡表面，VAMP7的BioID富集了HOPS複合物（內吞溶酶體融合），溶酶體相關， mTORC1複合物蛋白及其上遊調控GATOR2複合體的相關蛋白。
在完全飢餓條件下，可通過添加基本胺基酸（EAAs）或者BSA+Gln來增加胞內胺基酸水平以激活mTORC1。因為輸入途徑的差別，這兩種來源的胺基酸對mTORC1的調控激活機制也產生了極大的差異。BSA+Gln可通過巨胞飲-內吞進入胞內，和溶酶體融合後被降解成基本胺基酸，轉運出溶酶體後再激活mTORC1。敲低HOPS複合物的表達，幹擾內吞溶酶體融合，將阻斷BSA+Gln激活mTORC1。同時溶酶體輸出胺基酸可不依賴於Rag GTPase，而RAB7和Retromer敲低均可影響mTORC1激活。
而基本胺基酸通過質膜上胺基酸轉運蛋白進入胞內後，通過胺基酸感受器來依次控制GATOR1/2和Rag GTPase，最後激活mTORC1。因此這一胺基酸途徑不受HOPS，AP3複合物的影響，但依賴於Rag GTPase蛋白。
綜上所述，兩種不同來源途徑的胺基酸依賴於不同的複合物來激活mTORC1；而溶酶體降解產生的胺基酸不依賴於GATOR-Rag來激活mTORC1，甚至GATOR-Rag軸對這一途徑的mTORC1激活有所抑制。這一現象背後的機制亟待進一步的深入探索。
使用新技術研究已知生物學過程獲得了新的認識；新技術的使用也使我們得以窺探到以前難以深入的生物學過程。
近日，Nature在線發表了MITDavid. Sabtini團隊的研究：MFSD12 mediates the import of cysteine into melanosomes and lysosomes。研究鑑定確認了首個負責向溶酶體輸入胺基酸的轉運蛋白MFSD12 ，MFSD12可能負責轉運半胱氨酸進入溶酶體內，調節色素形成和溶酶體穩態平衡。
黑色素體是類溶酶體細胞器，負責色素的合成和分泌。作者將黑色素體膜蛋白GPR143插上3xHA標籤，在細胞中迅速分離富集這一細胞器，對其進行蛋白組和代謝組分析，以深入探索黑色素合成分泌的機制。
MFSD12在多項GWAS實驗中發現和不同人種的膚色差異相關，它的缺失可造成色素合成增加色素加深。MFSD12也定位於黑色素體和溶酶體上，但其具體的功能未知。作者利用這項快速分離細胞器的方法，檢測了MFSD12缺失的黑色素體中的代謝產物情況，並發現mfsd12-/-的黑色素體中胱氨酸（cystin）水平急劇降低。他們推測半胱氨酸水平（cysteine）的降低造成了胱氨酸減少。與此同時，mfsd12-/-黑色素體還檢測到半胱氨酸和絡氨酸的產物cysteinyldopas的減少，和他們的推測相符合。在293細胞中，作者也檢測到伴隨mfsd12的缺失，溶酶體中胱氨酸水平降低。上述實驗結果表明，MFSD12蛋白和半胱氨酸在溶酶體中的累積密切相關。
進一步實驗表明，突變的MFSD12蛋白可駐留在細胞膜上，引起[35S]cysteine向胞內累積。而未標記的cysteine可競爭MFSD12，減少[35S]cysteine向胞內累積。結果提示MFSD12可能直接負責向溶酶體和黑色素體轉運半胱氨酸。
遺憾的是，作者未能完成在人工脂質體上進行MFSD12對半胱氨酸的直接轉運實驗，但眾多實驗證據均提示了MFSD12可能直接向溶酶體內輸入半胱氨酸；而這是首個發現的溶酶體胺基酸輸入蛋白。
溶酶體降解輸入的蛋白質和肽段，貯存胺基酸，向細胞輸出胺基酸，可直接激活mTORC1控制合成代謝。一直以來，發現多個溶酶體胺基酸轉運蛋白，均是負責輸出。MFSD12蛋白的功能鑑定，則提示了胺基酸在溶酶體可出也可進，進一步說明了溶酶體在細胞能量代謝穩態維持的重要作用。半胱氨酸是細胞氧化還原狀態調節的重要分子，其轉運蛋白CTNS的異常造成了胱氨酸溶酶體儲積病症；溶酶體內半胱氨酸水平升高可造成線粒體功能異常鐵平衡改變和機體衰老（Cell | 半胱氨酸毒性導致衰老相關線粒體減少）。MFSD12功能的確認和深入分析，將有助於科學家找到更多維持溶酶體功能和調控活性的方法。
原文連結：
1. https://science.sciencemag.org/content/370/6514/351.full
2. https://www.nature.com/articles/s41586-020-2937-x