ReNeuron公司的hRPC療法對於視網膜色素變性患者的利弊分析

知乎作者：17RobertLIAN

ReNeuron公司作為一家少有的以幹細胞療法為主導的上市公司，專注於開發各種類型的罕見病創新療法，其hRPC項目是當今眼科領域備受關注的焦點之一。本篇微型綜述將從RP致病機理，hRPC的技術原理，臨床結果分析，以及療法適用對象群四個角度來論證hRPC項目對於視網膜色素變性患者的利弊。由於是科普類型的文章，所以引述忽略。

視網膜色素變性（Retinitis Pigmentosa），一個遺傳異質性（heterogeneity）極高的遺傳病/罕見病，具有堪稱目前罕見病領域的聖杯這個說法。視網膜色素變性（以下簡稱RP）的發病機理主要是位於眼底的杆細胞（rod photoreceptor）由於獲得功能性突變（gain-of-function）和失去功能性突變（loss-of-function）從而導致細胞的生化/代謝異常，其引發的炎症微環境使大量周邊細胞組織，例如錐細胞（cone photoreceptor）和色素上皮細胞（retinal pigment epithelium）誘發凋亡（apoptosis）。如果從細胞分子生物學層面具體闡述RP的機理的話，每個患者個體都能得到不同的解釋。表型和遺傳模式不作贅述。

自從2006年起，便有團隊試圖開發使用感光細胞的祖細胞（photoreceptor progenitor）以達到補全患者缺失的感光細胞這一思路。感光細胞的祖細胞全名為人類視網膜祖細胞（human Retinal Progenitor Cell，簡稱hRPC），位於眼底周圍的纖毛體區域（ciliary marginal zone/ciliary body）。takahashi的科研團隊最早發現了斑馬魚具有修復其受損眼底的功能，然而人類並不具備這樣的功能。hRPC被驗證了具有自我複製（proliferation）和持續特化為感光細胞或神經節細胞的功能（differentiation）。以斑馬魚為例，最早在胚胎發育（gestation）時，視網膜幹細胞（retinal stem cell，簡稱RSC）持續轉化為分化後RPC（post-mitotic RPC）。隨著不斷分化特化，剩餘的RPC被推向了位於視網膜終端的兩個纖毛體區域（該結論引述自我的導師Vincent Tropepe的團隊）。Pulse-Chase實驗證明了，特化後的上述感光細胞和各類神經細胞，在Notch1a/Delta-C信號作用下以類似傳送帶的運動向視網膜中心緩慢推進並發育為成熟的視網膜組織。在斑馬魚眼底損傷修復過程中，RSC聚集在切緣周圍並分化為RPC，從兩端向切口中心分化特化各類組成視網膜組織的細胞，最終填滿切口。這個神奇的機制被部分科研團隊用作參考，開發出了一套適用於人體的尚不完美的hRPC視網膜修復技術。

（偷懶就沒有去找原論文裡的圖，就用了上課時候的筆記。CMZ就是纖毛體區域，可以看到在纖毛體最邊緣的地方，也就是上圖的左側有一個CMZ-peripheral區域，這裡是斑馬魚特有的RSC細胞，逐漸往右也就是視網膜中心地帶出現了CMZ-middle區域，也就是RPC所在的地方，再往右就是一層一層的視網膜組織結構了。我們所說的RPC就是從這個CMZ-middle區域裡拿出來的。）

ReNeuron公司的hRPC，來源於發育16-18周的人類胚胎眼部，在低氧環境下進行快速擴增分裂，直到獲得患者所需的細胞用量。具體的培養方法和環境配置我不了解，這應該是ReNeuron公司的技術專利，畢竟如此大規模的細胞擴增卻能夠維持hRPC處在未分化狀態（undifferentiated）是非常非常不容易的。ReNeuron公司所採用的hRPC細胞系GS086，通過視網膜下注射（subretinal injection）的方式移植入眼底，目前正在探索合理的臨床使用劑量，也就是注射的hRPC數量。多項指標，例如Opsin，一種只有分化後感光細胞才會表達的標記，在實驗小鼠的眼底被探測到。組織顯微觀察也被用於證實，移植後的hRPC是具有分化能力並融合入視網膜組織的。由於臨床實驗周期實在太短，加上我們無法直接切開患者的眼球分析其眼底並進行顯微觀察，所以根本無法真正意義上確定移植到人視網膜後的hRPC是否具有分化成為感光細胞和自我分裂的能力。在本次文章修改中，我加入了重慶第三軍醫大學附屬西南眼科醫院的團隊做的動物實驗的數據，我個人認為他們的數據具有參照價值，能夠用來推測在人體的hRPC移植後細胞狀態。判斷移植後hRPC狀態的指標有，hRPC的水平和縱向移動狀態，移植後細胞分化為感光細胞的數量，hRPC移植後的炎症情況。由於是科普類型的文章，具體的數據分析我就不詳細說明了，大家看著也累，沒啥意思，如果有朋友真的需要具體數據的話請私信我，我把原文的doi發給您。hRPC移植後展現了良好的水平移動並縱向移動至視網膜內層，感光細胞分化的比例並不高，hRPC移植後的炎症微環境顯示出了明顯的抑制狀態。因此我們可以推斷，ReNeuron的hRPC移植所帶來的療效主要是由於hRPC具有抑制炎症微環境的作用，其次是分化為感光細胞從而替代失去的感光細胞。後者的療效十分有限，由於hRPC移植後分化為感光細胞的比例非常小，雖然沒有查到準確數據，但一位可靠的同行告訴我實際轉化率只有5%。我們指望的是hRPC注射後所帶來的NGF和BDNF增加，和TGFbeta/IL-1b減少，也就是炎症抑制能力。綜合來看，hRPC移植本身並不會帶來炎症反應，可能的炎症反應來源於視網膜下注射這個手術方法。

此處需要補充一下當前與RP治療相關的手術信息。眼球內注射（intraocular injection，是一個統稱）是當前治療眼底病最常用的給藥手段，例如針對年齡相關黃斑變性（age-related macular degeneration，簡稱AMD）的抗血管內皮生成因子療法（anti-VEGF），就廣泛使用到了玻璃體內注射（intravitreal injection）這個方法。我們熟知的AMD特效藥雷珠單抗，前不久在中國大陸上市並納入了全民醫保。針對雷珠單抗對於黃斑水腫（macular edema）的療效，之後會專門寫一篇文章分析目前的臨床結果。玻璃體內注射的優勢在於操作簡單且給藥迅速，大部分眼科醫生都具備這個手術能力。劣勢在於，玻璃體內注射有小概率會導致眼球內發炎（intraocular inflammation），視網膜脫落（retina detachment），凝血和白內障（cataract），以及病人的恐懼和不配合（incompliance）。注射後藥物接觸到視網膜偏後部分組織的概率也非常低，針對RP等眼底病的治療效率相對而言偏低。據一位可靠同行的消息，近年來玻璃體下注射的風險已經降到很低了，基本大家都可以去做這個手術。視網膜下注射（subretinal injection）的應用近年來開始逐漸廣泛起來，尤其是在眼科基因療法方面，視網膜下注射成為了使用攜帶重組基因組的病毒載體治療RP和Leber先天性黑朦症（Leber's congenital amaurosis，簡稱LCA）的黃金標準。我們所熟知的針對RPE65突變的基因療法Luxturna和針對MERTK突變的基因療法就採用了視網膜下注射的手術方法，與其類似的還有國際上針對Stargardt症的療法開發團隊也在考慮使用這個方法。相比玻璃體內注射，視網膜下注射的優勢在於能夠更直接的接觸到標靶組織，例如RPE和錐杆細胞。其劣勢在於如何保持給藥後的有效時長。ReNeuron的hRPC療法採用了視網膜下注射的手術方式，我們將側重於介紹視網膜下注射的流程和挑戰。視網膜下注射應用於細胞移植療法，雖然理論上說是相對安全的，但值得注意的是學術界依然報告了一例接受了自體骨髓細胞誘導間充質細胞（hBMSC）移植治療Stargardt黃斑營養不良的患者出現了嚴重的視網膜脫落，好在接受了後期的手術後這位患者的視力恢復到了接受療法之前的狀態。這個消息無疑是不利的，這從側面印證了視網膜下注射實際上具有較大的手術風險，可能會導致一系列的併發症。據那位可靠同行的消息，一部分原先計劃採用視網膜下注射病毒載體進行基因療法的團隊都在修改其病毒載體，並轉而使用玻璃體內注射的給藥方法。而且有研究表明視網膜下注射的細胞有效時長僅為半年到一年，有可能需要頻繁手術。但由於幾乎所有接受這種手術方式的患者都處在臨床實驗階段，所以對外發布的臨床結果實在有限，很難從理論上分析出實際的移植後hRPC有效時長。視網膜下注射目前有三個分類。第一種是角膜穿刺，針頭經過瞳孔，晶狀體，玻璃體再到視網膜下。第二種是鞏膜穿刺，針頭經過睫狀肌平坦部（pars plana）或角膜緣（limbus），玻璃體，然後到達對面的視網膜部分，最後是視網膜下。第三種是從脈絡膜（choroid）和Bruch膜開始，不穿透視網膜的鞏膜穿刺手術。ReNeuron的hRPC移植採用的是第二種手術方式。手術時醫生通過一個特製的顯微鏡來控制針頭，最後看到一個類似水泡（bleb formation）的東西產生後，就說明手術成功了。以下是圖解。

hRPC項目於2015年12月進入臨床一期（Phase1），首次在國際眼科學會ARVO上面向投資者亮相。當初曾因技術思想先進而轟動。隨著一期證明了移植後細胞安全且無可見免疫反應，其團隊快速開展了Phase 1/2a期的實驗。2a期旨在延長1期實驗對象中兩個視力極差且並無太大希望從療法中收益的對象進行為期12個月的觀察，其中期數據在2019年ARVO上公布了出來，這也是我們現在所擁有的針對ReNeuron的hRPC項目的最新的數據。由於1期和臨床前動物實驗結果不具備太大的代表性，我們無法從這些數據中預測人類患者接受hRPC移植後恢復的概率和程度，因此我們只對2a期以及原定於今年五月中旬ARVO上公布的完整12個月跟蹤結果進行分析。任何器官移植都需要伴隨人類白血球抗原（HLA）配型，眾所周知，每個人都攜帶有兩組等位HLA，雜合或者純和。一旦有HLA不匹配的細胞組織出現在體內，就會被免疫系統識別為是外源組織，從而激活免疫反應，將HLA不匹配的組織消除，也被稱為是免疫排斥。因此，免疫反應是hRPC移植中不得不面臨的一個難題。好在人類眼底是一個免疫特權區域（immune privilege），由於血眼屏障（eye-retina barrier）的存在以及幾乎不存在的周邊淋巴組織，眼底所可能造成的排斥性免疫反應大大低於其它身體組織可能造成的排斥反應。眼底還存在有大量自體產生的免疫抑制因子，並積極的主動降低系統性免疫反應。最常見的例子是角膜移植，角膜移植的成功率高達90%！這也意味著眼底是細胞移植療法和基因療法最適合的靶點。目前三個實驗對象並未報告任何嚴重眼底免疫反應，這是一件皆大歡喜的好事。hRPC移植中還需要擔心的一點是可能的致癌性。人類胚胎幹細胞（hESC）是一種不斷分裂並不進入G0期的細胞，其特性十分類似癌細胞，但ReNeuron所使用的hRPC來源於發育中期的人胚胎，於是杜絕了hESC汙染的可能性，因此致癌可能性也降到了最低。從接受hRPC移植手術的三個實驗對象的恢復情況來看，第一個實驗對象從9個字母的治療前基礎指標，兩個月內提升到了29個字母。其它兩個實驗對象分別在18天內從9個字母提升到了24個字母和從32個字母提升到了46個字母。三個實驗對象作為對照組的另一隻未接受移植眼並未有顯著改變。其數據表明了hRPC移植是積極有效的，即使是在治癒希望渺茫的患者身上，同時也證明了病程發展較早且不算嚴重的患者擁有更高的從hRPC移植中獲得益處的可能性。第二組實驗對象共計三人已經於2019年五月完成了招募，這一組實驗對象招募（2b期）的主要目的是探索最大有效劑量，也就是從治療中獲得最大益處時所需的hRPC移植數量。2a期所使用的單眼注射hRPC細胞數量為20萬個，相比1期時數量為10萬個或十萬個以下（250k，500k，1M），在治療前視力基線幾乎相同的患者中進行對照，較大劑量的2a期為患者帶來了更高的視力提升，證實了劑量和恢復程度具有關聯性。此外，ReNeuron公司已經向MHRA提交了申請，將在英國牛津眼科醫院進行面向公眾開放的臨床實驗，本次臨床實驗由知名的眼疾病專家Robert MacLaren教授主導。

這份數據統計中的樣本是混合了四個手術失敗後喪失視力的患者的數據的，也就是說如果除去這四個無效樣本的話，整體的恢復水平還是不錯的

從2a期結論我們可以看出，hRPC這種廣譜的RP或AMD或LCA療法適用於大部分退行性眼底病患者。但由於每個患者的病程，年齡，生活環境，基因型都不同，很難對hRPC移植所能夠帶給RP患者的益處進行一個量化的表述。我們目前可以推測出來的結論是，在發病早期接受hRPC移植所能夠給患者帶來的益處最多，在病程最晚期接受hRPC移植所能夠帶來的益處最少。由於患者招募條件中排除了青光眼，黃斑水腫，視網膜脫落，嚴重晶狀體混濁，糖尿病，以及吸菸的患者，我們有理由推測滿足以上這幾類條件的患者並不能從hRPC移植中獲得益處。hRPC移植後的可持續性並不能被推測出來。手術中可能造成的二次損害並沒有足夠的證據來做合理的推測。對於定價，我們有理由推測hRPC移植所需的費用極高。在臨床1期，GS086細胞系擴增到滿足一隻眼睛的hRPC注射用量，總計花費了4個月，市場化後單眼注射劑量會更高，生產耗費成本也將更高。我們以造血幹細胞體外編輯移植療法的成本為例，今年初剛剛報導了一例HIV感染患者接受體外CCR5del處理並移植的患者，這項手術的成本約為50萬rmb。針對hRPC，我個人的推測是，一位患者接受雙眼hRPC移植的費用約為50萬rmb。針對細胞療法的療程有效時長並沒有一個準確的臨床數據，但從豬hRPC移植的情況看，移植後細胞存活時間非常長，但受制於視網膜下注射的較短有效期，頻繁手術還是不可避免的。