幹細胞應用——細胞的代次如何選擇？

2020-10-23 幹細胞應用

回顧過去幾百年人類發展的歷史，19世紀是以蒸汽機為代表的工業革命世紀，20世紀是以計算機和通信為代表的信息技術的時代，而21世紀將是以生物技術為代表的生命科學與技術的世紀。


幹細胞技術是生物技術的核心內容之一。基於幹細胞的再生醫學或組織再生調節是繼藥物和手術調節之後的又一次醫療技術革命，幹細胞調節在疾病的康復階段具有更加重要的意義。隨著科學人員的不斷探索，糖尿病、心臟病、阿爾茲海默症等難治性疾病的治療也迎來了新的希望。


而在用幹細胞調節疾病中應關注調節時機、給藥途徑、細胞類型選擇、使用數量等多種問題。在多因素之間找到最佳的可行方案，方能助力這項技術更快落地應用。


目前臨床研究中，MSC應用較為常見的來源骨髓、脂肪、臍帶、胎盤等，本文以臍帶、脂肪、胎盤這三類比較常見的來源進行總結，針對不同來源間充質幹細胞，體外傳代培養後不同代次的一些生物學特性的變化（例如：細胞形態、細胞周期檢測、表面標記物檢測、染色體核型分析、相關基因表達及細胞因子的定量分析），因可供參考資料有限，不足之處請諒解。


臍帶


在各類不同來源的間充質幹細胞中, 人臍帶來源間充質幹細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)作為更為「年輕」的成體間充質幹細胞,具備有出生前和出生後MSC的綜合優點而受到越來越廣泛的關注。

人臍帶間充質幹細胞長期體外傳代培養後其基本的幹細胞生物學屬性, 如細胞表面免疫標誌物和誘導多向分化潛能, 無顯著性改變。長期培養至20代, 未發現致病性或致瘤性基因變異。高代次(P20)hUC-MSCs的細胞增殖活性和端粒酶活性與早期低代次(P5)細胞無顯著性差異。隨著培養代次的增加, 細胞開始出現老化, 尤以20代細胞表現最為明顯。

不同代次人臍帶間充質幹細胞的形態學觀察

體外傳代培養至第5、10代hUC-MSCs呈現完全相同的細胞形態與生長排列方式, 均呈現長梭狀貼壁生長, 輕度螺旋流水狀排列。第20代細胞呈現非常相似的長梭狀貼壁生長, 但胞體略顯增大, 融合後局部排列紊亂。


已有研究顯示, 雖然高代次培養的hUC-MSCs染色體組型依然保持穩定,但至第7代時其端粒酶活性會有所下降。我們通過檢測人端粒酶逆轉錄酶活性亞單位基因的表達顯示, 第5、10和20代hUC-MSCs的端粒酶活性之間並沒有顯著性差異; 且不同代次細胞呈現相似的生長增殖曲線, 表明它們的細胞增殖活力也無差異性。

不同代次人臍帶間充質幹細胞的增殖活性檢測


不同代次(第5、10、20代)的hUC-MSCs以同樣密度接種於6孔培養板中, 每天分別收集3孔不同代次的hUC-MSCs計數繪製生長曲線。圖示代表3次重複實驗。


除此以外，因專業性較強及篇幅有限，類似（常規核型分析、染色體核型分析、表面標記物檢測、基因表達和細胞因子定量分析）就不再贅述了。總言之，雖然第20代hUC-MSCs依然保持與低代細胞類似的幹細胞生物學屬性、基因穩定性和生長特徵, 隨著傳代培養時間的延長, 細胞開始呈現一定程度的老化現象。鑑於過度的傳代培養會導致hUC-MSCs出現老化徵象, 建議用於幹細胞臨床調節的hUC-MSCs體外培養最好不超過第10代。


胎盤

間充質幹細胞來源豐富，胎盤間充質幹細胞同樣具備取材方便等優勢，足月的胎盤是胎兒娩出後的廢棄物，容易獲得並且體積大獲得的數量多，科研成本低廉，不涉及社會、倫理等問題，而且胎盤間充質幹細胞有類似於骨髓間充質幹細胞的功能和特性，並且具有優於骨髓間充質幹細胞的增殖能力，能夠大量擴增間充質幹細胞的數量。

有研究分別對P5、P10和P15代細胞的增殖能力進行了檢測，結果顯示P5代間充質幹細胞的增殖能力明顯高於P10和P15代，實驗結果表明，胎盤間充質幹細胞在體外培養時，隨著細胞代次的增加，細胞會逐漸出現的老化。由於胎盤幹間充質細胞在P5代後增殖能力會逐漸的下降，所以作為臨床應用時最好選擇P5代以下的間充質幹細胞進行體外培養。

胎盤間充質幹細胞鏡下形態

圖註：圖中 A 為細胞貼壁後形態均一，呈長梭形，平行或漩渦狀生長(×100)；B 為第 25 代細胞形態呈鋪路石樣改變 (40×4)。

胎盤間充質幹細胞生長曲線、增殖能力及傳代結果


圖註：圖中A為P5代細胞的倍增時間明顯短於P10代和P15代細胞的倍增時間；圖B為不同代次的胎盤間充質幹細胞增殖能力不同，P5代增殖能力明顯高於P10和P15代，與P5代比，aP < 0.01，bP < 0.001，與 P10 代比，c < 0.05；C 為胎盤間充質幹細胞5例標本傳至25代，無貼壁細胞或貼壁不牢，但增殖速度快。

在該項研究中，胎盤間充質幹細胞可以長期傳代到第 25 代，不同代次的胎盤間充質幹細胞增殖能力不同，P5代增殖能力明顯高於 P10 和 P15 代，揭示了臨床應用應以P5 代之前為宜。


脂肪

脂肪間充質幹細胞 (adipose derived mesenchymal stem cells，ADSCs)是一類存在於脂肪組織 中具有多向分化潛能的幹細胞。細胞來源更加豐富、取材更為方便。而且其免疫原性很低，體外擴增也較加容易，這些優點使其在組織工程、創面修復和基因治療等方面具有了更加良好的應用前景。

有研究對ADSCs進行體外培養至 1、3、5、7、l0、14和 15代，發現ADSCs傳代至第7代後，細胞增殖速度開始減慢 ，10代後細胞增殖速度顯著減慢。細胞形態為長梭形並保持穩定。

細胞形態觀察


染色體細胞核型沒有明顯易位和缺失等變化，相關基因表達量略有差異，培養基內分泌的細胞因子保持穩定。

細胞因子定量分析


研究表明（利用無血清培養基培養的）脂肪間充質幹細胞在傳代至5代的過程中，生物學特性及遺傳特性基本穩定，沒有明顯變化。初步揭示了脂肪間充質幹細胞體外傳代至第5代以內可以安全使用 。


結語：

通過上述研究不難看出，間充質幹細胞理論上可以長期傳代培養，但在臨床應用中不建議選擇代次較高的幹細胞批次。未經體外擴增的MSC，細胞本身是安全無害的，除非本身有某種基因缺陷，體外擴增最大的風險在於基因突變。有一研究小組發現骨髓MSC體外培養至18代時，出現基因突變、染色體異常。其他大量的研究證實，MSC在體外培養代數過高（超過10代）的情況下才會引起染色體異常。


參考資料：

[1] 體外培養傳代人脂肪 、臍帶、胎盤間充質幹細胞的遺傳特性比較研究

[2] 長期傳代培養對人臍帶間充質幹細胞生物學特性的影響

[3] Best practices in cell culture: an overview

[4] 胎盤間充質幹細胞傳代後的增殖能力

[5] 人脂肪間充質幹細胞體外傳代的遺傳特性分析

[6] Stability of human mesenchymal stem cells during in vitro culture:considerations for cell therapy

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