Science:重大進展!構建出增加基因組靶向範圍的CRISPR/Cas9系統

2021-01-10 生物谷

2018年9月23日/

生物谷

BIOON/---基因組編輯技術CRISPR/Cas9被《科學》雜誌列為2013年年度十大科技進展之一，受到人們的高度重視。CRISPR是規律間隔性成簇短回文重複序列的簡稱，Cas是CRISPR相關蛋白的簡稱。CRISPR/Cas最初是在細菌體內發現的，是

細菌

用來識別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防禦系統。

在CRISPR/Cas9系統中，酶Cas9在DNA靶位點上進行切割，其中這種靶位點是這樣確定的：一種被稱作CRISPR RNA（crRNA）的RNA分子利用它的一部分序列與另一種被稱作tracrRNA的RNA分子通過鹼基配對結合在一起，形成嵌合RNA（tracrRNA/crRNA），然後，藉助crRNA的另一部分序列與靶DNA位點進行鹼基配對，以這種方式，這種嵌合RNA就能夠引導Cas9結合到這個靶位點上並進行切割。在實際應用時，人們可以將tracrRNA和crRNA作為兩種嚮導RNA（gRNA）或者融合在一起形成單向導RNA（single guide RNA, sgRNA），並被用來引導酶Cas9結合到靶DNA序列上並進行切割，其中Cas9與sgRNA一起被稱作Cas9-sgRNA系統。

此外，CRISPR/Cas9系統靶向識別和切割與前間隔序列鄰近基序（protospacer adjacent motif, PAM）相鄰的特定DNA位點。作為一種最為頻繁用於基因組編輯的Cas9酶，來自釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的Cas9（SpCas9）僅識別作為PAM的NGG序列（簡稱NGG PAM，其中N代表任何一種鹼基），這就限制了基因組中能夠被靶向的區域。

圖片來自Frontiers in Genetics, 24 September 2015, doi:10.3389/fgene.2015.00300。


在一項新的研究中，為了解決這個限制，來自日本東京大學、慶應義塾大學、大阪大學和美國布羅德研究所、麥戈文腦研究所和麻省理工學院的研究人員構建出一種合理設計的SpCas9變異體（SpCas9-NG），它能夠識別NG而不是NGG。這種SpCas9-NG變異體增加了基因組中的靶向範圍，但是具有與野生型SpCas9類似的特異性。晶體結構揭示出與第三個鹼基之間的鹼基特異性相互作用的喪失得到新引人的非鹼基特異性相互作用的補償，從而能夠識別作為PAM 的NG序列（NG PAM）。

這些研究人員進一步證實在人細胞中，這種SpCas9-NG變異體在攜帶著NG PAM的內源性靶位點中誘導鹼基插入或刪除（insertion or deletion, indel）。

最後，這些研究人員還發現將這種SpCas9-NG變異體與活化誘導的胞苷脫氨酶（activation-induced cytidine deaminase, AID）融合在一起能夠調節人細胞中攜帶著NG PAM的靶位點上的C→T轉化，即由鹼基胞嘧啶（C）轉化為鹼基胸腺嘧啶（T）。

綜上所述，SpCas9-NG是CRISPR/Cas9基因組工程工具箱的有力補充，可用於從

基礎研究

到臨床治療的一系列應用中。（生物谷 Bioon.com）

參考資料：Hiroshi Nishimasu, Xi Shi, Soh Ishiguro et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science, 21 Sep 2018, 361(6408):1259-1262, doi:10.1126/science.aas9129.

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