質譜流式和光譜流式的原理和優缺點介紹,你認為哪個更有前途?

2021-01-16 流式中文網

流式細胞儀仍然是無與倫比的單細胞分析技術，分析數百萬甚至更多細胞上的多個螢光參數的能力，使得流式能夠幫助人類深入理解複雜的生物過程。然而，常規流式在發展過程中，漸漸表現出一些缺陷，主要表現為螢光染料的限制，即使方案經過精心設計，也無法避免光譜滲漏、自發螢光等問題，使用的螢光染料的數量越多，這些問題就越大。

質譜流式

為了克服這個問題，先是出現了質譜流式。質譜流式的基礎原理是飛行時間質譜（TOF-MS），TOF-MS是一種非常精確和穩健的方法，用於測量離子的質荷比。在TOF分析中，所有離子通過已知強度的電場加速，並且測量這些離子在已知距離上到達檢測器所花費的時間。離子越重，到達探測器所需的時間越長。

在質譜流式中，選擇的標記是高度純化的穩定同位素。

為了進行質譜流式檢測，需要將同位素引入TOF並且避免細胞汙染儀器，這就需要將細胞氣化，僅留下同位素，為此，在進行TOF之前，需先將引入電感耦合等離子體（ICP）使細胞氣化，將剩餘的金屬離子引入TOF檢測。

所以，通過穩定同位素抗體的標記，經過ICP的細胞氣化，最後通過TOF-MS檢測離子，三者合一，就是質譜流式。原理繪製成一張圖就是下面這樣：

質譜流式的優點：

可以使用傳統的標記技術，在方法學上改變很小 

在質譜細胞計數中沒有「自發螢光」，因為細胞內部不含鑭系元素離子

無「補償」 或補償非常微小 

方案設計更容易

但任何事物都有局限性，質譜流式的缺點：

與傳統的流式細胞儀相比，採集速度更慢，每秒一般最多約1000個事件

樣品製備必須比傳統流式更乾淨，因此在獲取時所有生物材料都會氣化，如果不乾淨可能導致碳積聚並降低靈敏度 

商業標記抗體數量有限（不過目前越來越多廠家加入，使得這些目錄逐漸在完善） 

複雜的數據結構，需要新的數據分析工具和方法 

由於細胞被氣化，所以沒法進行FSC和SSC測量

光譜流式

光譜流式是從另一條路解決螢光補償問題，就是光譜解析，解析原理見下圖，需要事先學習螢光素的光譜特徵，不同螢光素都有其獨特的光譜特徵，有點像人臉識別似的，只不過比人臉識別簡單多了。通過這種解析，就智能得消除了常規流式累死人的螢光滲漏影響：

但實際上在硬體上，光譜流式同時還大大降低了光路的複雜程度，使得儀器成本能夠大大降低。常規流式要做到12色，可能需要12～14個獨立檢測器和40多個濾光片，而光譜流式，不僅避免了這種複雜架構，而且實現同等參數檢測的儀器成本只有常規流式的五分之一。

光譜流式最開始是Purdue大學2004年ISAC會議上提出的，2007年10月9日獲得專利US7280204（http://www.cyto.purdue.edu/sites/default/files/manuscripts/US7280204-issued-patent.pdf），專利後來授權給了索尼，Purdue大學該頁面（http://www.cyto.purdue.edu/Spectral%20Flow%20Cytometry）還有幾個蠻有意思的聲明，在此不方便直接翻譯，不知道是否有知情人能解答一下？

對於光譜流式，同樣也有優點和缺點。優點是：

與常規流式在方法學一致，可直接拿來就用，過渡性好 

能通過特異性光譜特徵，方便地去除「自發螢光」信號 

即使以前發射波長相近的螢光素，例如GFP和FITC，由于波形不一樣，在光譜流式上也能解析開 

方案設計更容易

缺點：目前在公開資料中未找到對光譜流式的缺點介紹，但事物都有兩面性，我個人雖然未用過光譜流式，但從光譜流式公司公開資料上的光譜流式與常規流式數據對比上看，可以看出在信號強度上，部分螢光素的強度整體是要弱於常規流式的，這可能對於某些微弱信號會有點麻煩，當然，這純屬個人猜測，請用過光譜流式的FLOWER能夠出來確認一下。

質譜流式vs光譜流式，你更好看哪項技術？

下面投個票，通過上面的簡單介紹，你覺得質譜流式和光譜流式，哪項技術更有前途？


參考文獻： 

Introducing CyTOF: Cytometry of the Masses. https://bitesizebio.com/20066/introducing-cytof-cytometry-of-the-masses/ John P. Nolan and Danilo Condello. Spectral Flow Cytometry. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3556726/ https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/cyto.a.23779 J. Paul Robinson. Spectral flow cytometry—Quo vadimus?http://www.cyto.purdue.edu/Spectral%20Flow%20Cytometry


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