植物組培汙染完美解決方案

植物組培廣泛應用於植物科研，如模式植物，作物育種等，工廠化生產，如觀賞花卉植物，中藥材生產，園林園藝等，但是組培過程中種苗的汙染是廣大工作者最頭疼的問題，尤其是真菌汙染，常用的抗生素根本無法有效的抑制和清除，來自美國Plant cell Technology公司的專家針對這一問題，研發了一款高效的植物組培微生物汙染清除試劑——PPM(Plant Preservative Mixture),該產品能非常有效的抑制和清除組培過程中產生的汙染問題，且無需過濾滅菌，能直接與培養基一同高壓滅菌，使用非常方便，此項發明也申請了專利：

產品專利說明：

PPM^TM - Plant Preservative Mixture是專利產品，其商品名稱，配方及使用方法等都受專利保護，專利號5,750,402。

產品名稱：PPM^TM - Plant Preservative Mixture（植物組織培養抗菌保護劑）

貨號：PPM

保存條件：4o C

運輸條件：常溫

物理性質：溶液

性狀：無色至琥珀色透明液體

pH值：3.8

有效期：見瓶身標籤說明

產品描述：

1.         PPM^TM 是一種熱穩定的抗菌劑，用於植物組織培養中植物的微生物汙染防治與清除；

2.         在合理的使用劑量下，PPM^TM是一種非常有效的植物組培抗菌劑與保護劑，不會對植物的生長（如種子萌發，愈傷增殖、再生等）產生任何影響，可視為培養基標準配方成份；

3.         PPM^TM主要用於預防和消除來自空氣、水源或者人體接觸等外界因素導致的植物組培過程中的微生物汙染，同時，對於植物內生菌也同樣具有非常好的抑制效果；

4.         PPM^TM廣泛適用於絕大多數被子植物和裸子植物，但是不推薦用於蕨類植物、藻類等水生植物；

5.         PPM^TM具有熱穩定性，能直接加入培養基高溫滅菌而不會影響使用效果，使用更加方便；

6.         PPM^TM 相對於常規抗生素而言，性價比更高。

作用機理：

PPM^TM的活性成分能滲透細菌或者真菌細胞壁，抑制呼吸作用中三羧酸循環和電子傳遞鏈過程中關鍵酶的活性，同時，也能阻斷細菌和真菌吸收和利用培養基中單糖和胺基酸的過程，從而實現預防和清除植物組織培養過程中的微生物汙染。

相對抗生素的優勢：

1.         PPM ^TM能廣泛抑制和清除細菌和真菌的汙染，並防止真菌孢子的萌發；

2.         PPM ^TM是通過抑制多種酶的活性而達到抑菌效果，從而能避免耐藥突變體的發生；

3.         PPM ^TM具有熱穩定性，無需過濾滅菌，能直接加入培養基高溫滅菌而不會影響使用效果，使用更加方便；

4.         PPM ^TM性價比更高，可更加廣泛的應用於更多的科學研究、作物育種、組培苗工廠化生產中。

 

 

常規使用簡介:

以下使用指南是針對大多數情況下的常規使用說明，特殊情況可做適當調整。

使用指南	汙染預防	消毒滅菌	抑制農桿菌
濃度 (v/v)	0.05 – 0.2%	5.0% (see note)	0.05%
處理時間	持續	4 – 12 hours	持續
說明	1. 具體使用濃度根據處理樣本有所不同； 2.原生質體和愈傷組織處理濃度建議為0.05%；	1. 將組織加入到含5%PPM?的3X MS*鹽溶液中，攪拌4-12小時； 2. 處理過程中無需其他滅菌方法同時使用，不能添加酸鹼試劑，調節pH，也不要加入Tween20等； 3.處理完成以後將組織轉移到含0.05%PPM的培養基中；	與其他抗生素配合使用效果更佳

*說明：MS鹽溶液是泛指，如樣本的培養基鹽溶液不是MS鹽，以具體適用的培養基鹽溶液為準；

操作說明：

以下操作說明是針對大多數情況下的常規使用說明，必要時，可根據具體植物樣本情況進行適當調整，如需更多指導可聯繫Dr. Assaf Guri at [e-mail]。

1.      常規用量：
一般推薦使用使用濃度為0.05%-0.2%（1L培養基中加入0.5-0.75ml PPM?），愈傷增殖，器官形成，胚性組織發育等使用濃度為0.05%-0.075%。

說明：
(a) 含有PPM?的培養基無需在超淨工作檯中分裝，在培養基凝固以後將培養瓶/皿蓋子蓋  

好即可。如使用自動灌裝系統，建議在灌裝前後將分裝管用高壓滅菌熱水處理；
(b) 如果培養基儲存液保存在無菌容器中並未經汙染的情況下，加入PPM?配製的培養基

無需再次過濾或者高溫滅菌。如果是營養培養基，如含有200mg/L甚至更高濃度胺基酸或者蛋白質的培養基，建議過濾滅菌。

2.      植物內生菌汙染處理：

(a) 種子：PPM?不推薦用於直接處理含有大量的細菌或真菌孢子的種子滅菌，對於種子離體萌發，建議先採用傳統方法消毒，然後置於含2-3%PPM?的全培養基礎鹽溶液中，輕輕攪拌4-12小時，此過程千萬不能添加Tween20和調節pH，處理完成以後直接插入含有PPM?(草本植物0.05-0.1%，木本植物0.2%)的培養基裡；

(b) 外植體：以1cm外植體為例，將外植體置於含4-5%PPM?的全培養基礎鹽溶液中，輕輕攪拌4-12小時，此過程千萬不能添加Tween20和調節pH，處理完成以後直接插入含有PPM?(草本植物0.05-0.1%，木本植物0.2%)的培養基裡；

(c) 對於塊莖，球莖和鱗狀物的觀賞植物樣本：將其整體放入消毒劑中攪拌消毒處理以後，用水衝洗乾淨，將材料切成薄片，置於含4-5%PPM?的全培養基礎鹽培養液中，輕輕攪拌4-12小時，此過程千萬不能添加Tween20和調節pH，處理完成以後無需衝洗直接插入含有0.1-0.2%的PPM?的培養基裡進行培養。

 

3.      如果厚的外植體、汙染嚴重的植株、種子等樣本經過以上處理仍得不到理想效果，可嘗試以下操作：

(a) 將材料浸泡在水中持續攪拌處理(鬆軟組織攪拌1小時，硬實組織攪拌2小時)；

(b) 將材料在含50%的PPM?全培養基礎鹽溶液中攪拌處理5-10分鐘，此過程千萬不能添加Tween20和調節pH；

(c) 無需衝洗，將處理過的材料直接加入到培養基中即可。對於真菌汙染，可在培養基中加入適當濃度的PPM?。對於真菌細菌混合性汙染，建議在培養的第一個月的培養基中加入0.05%-0.2%的PPM?。

4.      嚴重汙染材料汙染去除與搶救（重汙染不超過一周）：

(a) 將汙染的材料至於流水中用軟刷刷洗，然後置於含50% PPM?的無菌水溶液中攪拌5-15分鐘，對於細菌或者混合性汙染，建議使用100% PPM?與0.6g/L的檸檬酸無菌水溶液按1：1混合的低pH(2.8-3.2)的酸性溶液處理；

(b) 處理後的材料無需清洗，直接插入含0.05%-0.25的PPM?的培養基中培養至少一個月以上，其中前10天需要弱光培養；

對於一些真菌、孢子和細菌汙染隱藏較深，PPM?無法接觸到的部位，建議在初步的清洗以後，將材料切開，然後再放入含50%PPM?的無菌水溶液中攪拌5-15分鐘處理。

5.      農桿菌的去除：

共培養以後，將樣本用無菌水清洗，然後將樣本浸沒在100% PPM?（補充4X的培養基鹽溶液）中處理2分鐘，取出後用無菌紙吸乾後並置於常用抗性培養基中培養，3周後，更換到只含有0.05%-0.075% PPM?(無常用抗生素)的培養基中培養。

使用注意事項：

1.     在所有PPM?消毒處理外植體的過程中，儘量保證容器的體積足夠大，並使外植體材料所有面積與含PPM的處理溶液充分接觸，以保證消毒效果；

2.     如果外植體出現高度氧化現象，不要扔棄，大約50%的外植體在4-6周內即可恢復；

3.      50% PPM? 的處理溶液可以重複使用但是不推薦，因為使用次數和效果受外植體的體積與接種密度的影響。將50% PPM? 的處理溶液保存在4oC 可適當延長其活性，一般可使用不超過10次。如果必要，建議配製2份50% PPM? 溶液，一份用於外植體消毒內生菌汙染，另一份用於消除「培養過程中」的輕度汙染材料搶救，第二份溶液在每次處理過後需要用0.2mm濾器過濾；

4.      如果50% PPM? 溶液處理效果不理想，可採用100% PPM? 溶液進行處理，處理方法相同，但使用次數不得超過10次。

安全說明：

1.      雖然PPM?是無毒性的，但是在使用過程中還需儘量避免直接與人體皮膚等直接接觸，建議使用時佩戴手套，保持空間空氣流通，如不慎吸入，先馬上因大量純淨水後立即就醫，如不慎入眼，立刻用大量水衝洗眼睛15分鐘，用肥皂清洗PPM?接觸過的皮膚部位；

2.      含PPM?的培養基垃圾處理與常規培養基處理方法相同。