1. 從冰箱中取-20℃冷凍保存的水化上樣緩衝液（I）（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1ml/管），置室溫溶解。
2. 在小管中加入0.01g DTT， Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml，充分混勻。
3. 從小管中取出400ml水化上樣緩衝液，加入100ml樣品，充分混勻。
4. 從冰箱中取-20℃冷凍保存的IPG預製膠條（17cm pH 4-7），室溫中放置10分鐘。
5. 沿著聚焦盤或水化盤中槽的邊緣至左而右線性加入樣品。在槽兩端各1cm左右不要加樣，中間的樣品液一定要連貫。注意：不要產生氣泡。否則影響到膠條中蛋白質的分布。
6. 當所有的蛋白質樣品都已經加入到聚焦盤或水化盤中後，用鑷子輕輕的去除預製IPG膠條上的保護層。
7. 分清膠條的正負極，輕輕地將IPG膠條膠面朝下置於聚焦盤或水化盤中樣品溶液上，使得膠條的正極（標有+）對應於聚焦盤的正極。確保膠條與電極緊密接觸。不要使樣品溶液弄到膠條背面的塑料支撐膜上，因為這些溶液不會被膠條吸收。同樣還要注意不使膠條下面的溶液產生氣泡。如果已經產生氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，上下移動膠條，直到氣泡被趕到膠條以外。
8. 在每根膠條上覆蓋2-3ml礦物油，防止膠條水化過程中液體的蒸發。需緩慢的加入礦物油，沿著膠條，使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上。
9. 對好正、負極，蓋上蓋子。設置等電聚焦程序。
10.聚焦結束的膠條。立即進行平衡、第二向SDS-PAGE電泳，否則將膠條置於樣品水化盤中，-20℃冰箱保存。
（二）第二向SDS-PAGE電泳
1. 配製10%的丙烯醯胺凝膠兩塊。配80ml凝膠溶液，每塊凝膠40ml，將溶液分別注入玻璃板夾層中，上部留1cm的空間，用MilliQ水、乙醇或水飽和正丁醇封面，保持膠面平整。聚合30分鐘。一般凝膠與上方液體分層後，表明凝膠已基本聚合。
2. 待凝膠凝固後，倒去分離膠表面的MilliQ水、乙醇或水飽和正丁醇，用MilliQ水衝洗。
3. 從-20℃冰箱中取出的膠條，先於室溫放置10分鐘，使其溶解。
4. 配製膠條平衡緩衝液I。
5．在桌上先放置幹的厚濾紙，聚焦好的膠條膠面朝上放在幹的厚濾紙上。將另一份厚濾紙用MilliQ水浸溼，擠去多餘水分，然後直接置於膠條上，輕輕吸乾膠條上的礦物油及多餘樣品。這可以減少凝膠染色時出現的縱條紋。
6. 將膠條轉移至溶漲盤中，每個槽一根膠條，在有膠條的槽中加入5ml膠條平衡緩衝液I。將樣品水化盤放在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。
7. 配製膠條平衡緩衝液II。
8. 第一次平衡結束後，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩衝液I。並用濾紙吸取多餘的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。再加入膠條平衡緩衝液II，繼續在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。
9. 用濾紙吸去SDS-PAGE聚丙烯醯胺凝膠上方玻璃板間多餘的液體。將處理好的第二向凝膠放在桌面上，長玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝膠的頂部對著自己。
10.將瓊脂糖封膠液進行加熱溶解。
11.將10×電泳緩衝液，用量筒稀釋10倍，成1×電泳緩衝液。趕去緩衝液表面的氣泡。
12.第二次平衡結束後，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩衝液II。並用濾紙吸取多餘的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。
13.將IPG膠條從樣品水化盤中移出，用鑷子夾住膠條的一端使膠面完全浸末在1×電泳緩衝液中。然後將膠條膠面朝上放在凝膠的長玻璃板上。其餘膠條同樣操作。
14.將放有膠條的SDS-PAGE凝膠轉移到灌膠架上，短玻璃板一面對著自己。在凝膠的上方加入低熔點瓊脂糖封膠液。
15.用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯醯胺凝膠膠面完全接觸。注意不要在膠條下方產生任何氣泡。在用鑷子、壓舌板或平頭針頭推膠條時，要注意是推動凝膠背面的支撐膜，不要碰到膠面。
16.放置5分鐘，使低熔點瓊脂糖封膠液徹底凝固。
17.在低熔點瓊脂糖封膠液完全凝固後。將凝膠轉移至電泳槽中。
18.在電泳槽加入電泳緩衝液後，接通電源，起始時用的低電流（5mA/gel/17cm）或低電壓，待樣品在完全走出IPG膠條，濃縮成一條線後，再加大電流（或電壓）（20-30mA/gel/17cm），待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時即可停止電泳。
19.電泳結束後，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，並切角以作記號（戴手套，防止汙染膠面）。
20.進行染色。