單細胞凝膠電泳技術的試驗步驟

2021-01-10 生物谷
單細胞凝膠電泳技術的試驗步驟

來源：來源網絡 2007-01-09 21:11

試劑及材料：
1）PBS
2）0.8%正常熔點凝膠（PBS配製）
3）0.6％低熔點凝膠（PBS配製）
4）毛玻璃片
5）蓋玻片
6）鹼性裂解液（2.5mol/L NaCl;100mmol/L Na2EDTA;10mmol/L Tris;1%肌氨酸鈉），臨用前加10％DNMSO，1％Triton X-100
7）電泳緩衝液（1mmol/L Na2EDTA;300mmol/L NaOH；Tris.Cl，pH7.5）
8）EB（2ug/ml）
步驟：
1.製備第一層膠：100ml 0.8％正常熔點膠，加蓋蓋玻片，4℃固化10min；
2.製備第二層膠：輕輕地去除蓋玻片，在第一層膠上滴加75ul含1×10000個細胞的0.6％低熔點膠（cell與凝膠比例為1：5），加蓋蓋玻片，4℃固化10min；
3.裂解：去掉蓋玻片，將凝膠浸入冰冷的鹼性裂解液內（臨用前加10％ DMAO，1％Triton X-100），4℃裂解1h；
4.取出玻片，用PBS緩衝液漂洗3次後置於水平電泳槽內，加入pH13的電泳緩衝液（沒過玻片2-3min），放置20min（黑閉）。
5.電泳：電壓20V，300mA，30min
6.取出玻片，用PBS或Tris.Cl，pH7.5漂洗3次，每次3min；
7.染色：膠上滴加3ulEB，加蓋蓋玻片，24h檢測。或者4℃，潮溼，閉光的條件下保有膠片，觀察時再染色，鏡檢。

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