液體活檢丨超萬例中國泛癌種患者ctDNA檢測分析,41.2%患者可受益於...

2021-01-18 健康界

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癌症基因組分析已顯著改變多種惡性腫瘤的臨床管理。TCGA項目和MSK-IMPACT隊列已經對多種癌症類型進行了全面的基因組分析，然而這些數據主要集中在白人患者中，缺乏來自亞洲患者的數據，這些患者分別佔總體癌症發病率和死亡率的50%和70%。

儘管中國是世界上人口最多的國家，但仍缺乏中國癌症患者的全面基因組信息，尤其是中國的泛癌種ctDNA檢測分析數據，因此，明確中國泛癌種患者的基因組圖譜有助於改善治療方案和生存率。

2021年1月4日，《Nat Commun》發表了超萬例中國泛癌種患者ctDNA檢測分析數據，對cfDNA中的克隆性造血變異，泛癌種的ctDNA可檢測性和分子特徵，泛癌種的ctDNA突變圖譜，腫瘤克隆結構和治療可操作性等方面進行了分析，有助於改善中國癌症患者的治療方案和生存率。1

此次分析共納入11,525例癌症患者的13,333份血液樣本，其中54.8%（7,303/13,333）來自IV期患者，11.4%（1,519/13,333）來自I-III期患者，33.8%（4,511/13,333）來自分期不詳患者。分析包括41種主要癌症類型，最常見的是非小細胞肺癌（n=5,548），其它常見類型包括結直腸癌（n=1,195），乳腺癌（n=1,178），上消化道癌症（n=575）和肝細胞癌（n=571）等。

樣本採集：室溫下，採用streck管採集10ml外周血，72h內處理；  cfDNA濃度：血漿cfDNA的平均提取濃度為31.9 ng/ml（1.05–396.0 ng/ml），各癌症類型之間無明顯差異；  檢測產品：1021基因 NGS 大panel，包括12種實體瘤常見驅動基因區域，化療、靶向及免疫相關基因區域，及COSMIC和TCGA記錄的高頻突變區域，大小為1.09Mb；  cfDNA測序：血漿cfDNA的中位測序深度為4,429X（1,000-30,368X），白細胞對照的中位測序深度為423X（369-7,279X）；  ① 超萬例cfDNA樣本中，  14%  會檢出克隆性造血變異；  

② 常見克隆性造血（CH）突變基因有15個，其中最常見的是DNMT3A，TP53，TET2和PPM1D；不同癌症的CH變異發生率不同，黑色素瘤，膀胱癌，子宮癌和前列腺癌中發生CH變異>20%，腎癌和甲狀腺癌中發生CH變異<10%，其他癌症中發生CH變異在10~20%之間；不同癌症的CH基因發生不同，TP53是黑色素瘤和小細胞肺癌中最常見的CH基因，而DNMT3A是子宮癌和宮頸癌中最常見的CH基因（圖1a）；

③ cfDNA中克隆性造血（CH）變異的等位基因頻率（AF），大多數在0~10%之間（圖1b）；

④ cfDNA中克隆性造血（CH）變異的等位基因頻率（AF）顯著低於非CH變異的AF（P<0.001）（圖1c）；

⑤ cfDNA中克隆性造血（CH）變異通常隨年齡的增長而增加，40以下CH變異發生率為9.1%，80歲以上CH變異發生率為23.1%（圖1d）；

⑥ 一些cfDNA中克隆性造血（CH）變異可能無法通過白細胞測序篩查出來，然而，與腫瘤來源的變體相比，這一比例將是有限的。對cfDNA，腫瘤組織和白細胞分別進行測序，然後將血漿cfDNA中檢測到的變異分為三類：cfDNA和WBC同時存在的變異（WBC-matched），cfDNA和組織活檢同時存在的變異（Biopsy-matched）及僅發生在cfDNA中的來源不明變異（VUSOs），顯示白細胞過濾可能不太乾淨，提示亞克隆變異是一個可能的來源。cfDNA中來源不明變異更少分布在CH相關基因中，不過血漿cfDNA中檢測的到的WBC-matched和VUSOs變異AF仍然顯著低於Biopsy-matched變異AF（圖1e，1f，1g）。

▲ 圖1. 通過匹配的WBC測序鑑定血漿cfDNA中CH變異 ① ctDNA檢測的總體靈敏度為73.5%（  消除克隆性造血變異後  ）；

② ctDNA的可檢測性因不同癌症類型而異，其中小細胞肺癌（91.1%），前列腺癌（87.9%），子宮癌（77.6%）、肝細胞肝癌（77.1%）和上消化道癌症（76.9%）顯示出比其他癌症更高的靈敏度；甲狀腺癌（41.8%）和腎癌（56.4%）的ctDNA可檢測率較低（圖2a）。此外，79.7% IV期樣本和57.9% I-III期樣本（提示可早篩）可檢測到基因變異；

③ ctDNA的等位基因頻率（AF）在不同癌症類型和相同癌症類型的不同樣本中均存在顯著差異，此外，與其他類型腫瘤相比，腦膠質瘤的ctDNA AF最低，可能是由於血腦屏障存在的緣故（圖2b）；

④ bTMB是一種潛在的免疫治療生物標誌物，小細胞肺癌，子宮癌，膀胱癌，結直腸癌和宮頸癌相較於其它癌種有更高的bTMB，但在甲狀腺癌和腦膠質瘤中bTMB最低（圖2c）。此外，該隊列與MSKCC組織TMB排名相似，但存在一些差異性，黑色素瘤和腦膠質瘤在MSKCC中bTMB較高，但在bTMB中較低，這表明ctDNA的脫落可能影響循環腫瘤負荷的測定；

⑤ 按照四分位75%來區分bTMB的高低，cut-off值為8.7 mut/Mb，超過一半的小細胞肺癌樣本被認為是bTMB-H（65/114，57%），此外，非小細胞肺癌，膀胱癌、結直腸癌和宮頸癌也佔較大比例的bTMB-H，表明應針對不同癌症類型分析確定bTMB的臨界值（圖2d，2e）；

⑥ 大多數癌症類型ctDNA檢測顯示出比MSKCC組織中更高的突變等位基因腫瘤異質性（MATH），這表明相較於單區域活檢（可能忽略亞克隆低AF變異），使用ctDNA突變等位基因腫瘤異質性（MATH）算法量化腫瘤異質性具有潛在的優勢（圖2f）。

① 根據先前的認知，發現不同癌症類型中的常見基因突變頻率與預期一致。比如非小細胞肺癌中EGFR（44.2%）突變，小細胞肺癌的RB1（63.4%）突變，結直腸癌中的APC（44.4％），KRAS（33.8％）和PIK3CA（11.2％）突變，肝細胞肝癌中的TERT啟動子SNV（22.3%）突變，胰腺癌中的KRAS（62.8％）和CDKN2A（17.2％）突變，乳腺癌中的PIK3CA（39.1%）突變等。此外，一半的血漿樣本cfDNA檢測出TP53突變（50.5%），並且在宮頸癌、胃腸道間質瘤、甲狀腺癌和黑色素瘤中TP53突變頻率<20%（圖3a）。

② ctDNA液體活檢與組織活檢檢測到的驅動基因頻率顯示出很強的線性關係（R2=0.87），總體上是一致的，但也存在不一致的地方。本研究觀察到的獨特的突變發生率可能暗示了中國癌症患者的致病驅動特徵，此外，樣本來源，測序方法，檢測靈敏度，患者性別和年齡分布等也可能導致這些差異（圖3b）。

▲ 圖3. 泛癌種ctDNA的突變態勢

③ 通過ctDNA評估與增殖潛能相關的10種典型信號通路的特定基因，最常見的是RTK-RAS通路變異（56.1%），其次是P53通路（53.9%）和PI3K通路（22.8%）；最顯著的特徵是RTK-RAS通路與其他通路之間沒有共存，RTK-RAS與P53/PI3K通路之間存在輕微的互斥性，這表明僅RTK-RAS通路就可以誘導腫瘤的發生，這些結果說明了不同通路之間的相互影響，揭示了功能上的相互作用和依賴關係，這些可以用於治療（圖4）。

MATH算法反映出ctDNA的高度異質性意味著其複雜的克隆結構。考慮到大多數樣本來自正在接受治療的晚期癌症患者，因此豐富的ctDNA可以重建基因組克隆性。

① 在整個血漿隊列中，突變的克隆性分布幾乎是雙峰的，其中兩個最大值通常分別下降>0.9和<0.1，不過不同癌種的主要克隆基因不同（圖5a）。在克隆性≥0.9的亞組中，9種常見驅動基因（TP53、EGFR、PIK3CA、KRAS、APC、RB1、NF1、ERBB2和BRAF）的變異百分比為47.1%，但在克隆性<0.1的亞組中變異頻率約為9.5%。

② TP53，EGFR，KRAS和PIK3CA在不同癌症類型中的克隆分布與既往報導一致，提示ctDNA定向克隆性分析是確定腫瘤克隆結構的有利選擇（圖5b）。

▲圖5. 預估的ctDNA克隆性與癌症亞型基因組特徵一致 基於ctDNA液體活檢最有意義的應用之一是尋找藥物敏感的標誌物，並為靶向治療進展的患者確定耐藥機制。

① 研究者分析了具有基因組變異的8,032例血漿樣本，並排除了組織學未知的肺癌和未知的原發癌樣本。根據OncoKB資料庫建立的標準和其他證據報告，研究者從3,306例樣本（41.2％）中檢測出4,665個潛在的藥物敏感性靶標。其中，2,299例樣本（28.6％）達到了1級用藥標準，100例樣本（1.2％）達到了2A級用藥標準，221例樣本（2.8％）達到了2B級用藥標準，226例樣本（2.8％）達到了3A級用藥標準，還有459例樣本（5.7％）達到了3B級用藥標準。在非小細胞肺癌，乳腺癌，上消化道癌症，胃腸道間質瘤，卵巢癌，膀胱癌，黑色素瘤和結直腸癌中均觀察到1級用藥物標準變異（圖6a）；

② 總共檢測到63種藥物敏感性標誌物，包括各癌種可行性通路變異靶標，最常見的是EGFR 19del（圖6b）；

③ 在幾種可能帶有藥物敏感性標誌物的癌症類型中，如非小細胞肺癌，胃腸道間質瘤，乳腺癌，宮頸癌和黑色素瘤中，標記物的克隆性通常高於其他類型，表明其藥物敏感克隆的細胞分數較高，提示靶向藥物的潛在效率和功效（圖6c）；

④ 此外，對137例按照ctDNA突變圖譜進行靶向治療的癌症患者成功完成了臨床隨訪，其中包括114例非小細胞肺癌，17例乳腺癌和6例結直腸癌。絕大多數患者為IV期，無進展生存期（PFS）為4~1198天。血漿ctDNA的突變數和AF均與患者PFS呈中等程度的負相關（圖7a）；突變數≤2的患者中位PFS為12.8個月，顯著長於突變數≥2的患者（中位數為5.1個月，圖 7b）；同樣，AF≤0.01的患者PFS（中位數，12.8個月）顯著大於AF> 0.01的患者（中位數，5.8個月）（圖7c）。這些結果表明，ctDNA還可以幫助預測治療的預後。

▲圖7. ctDNA圖譜測定的循環腫瘤負荷與治療預後相關

綜合可見，ctDNA提供了一種非侵入性方法來闡明癌症患者的基因組全景和可操作信息。超萬例中國泛癌種患者的血漿cfDNA和白細胞平行測序顯示，cfDNA中有14%會檢出克隆性造血變異，其可檢測性隨年齡增長而增加。消除克隆性造血變異後，在73.5%的血漿樣本中檢測到ctDNA，其中小細胞肺癌（91.1%）和前列腺癌（87.9%）顯示出最高的可檢測性。ctDNA液體活檢與組織活檢檢測到的驅動基因頻率相似（R2=0.87），但也顯示出一些差異，例如非小細胞肺癌中較高的EGFR突變頻率（44.8％ vs 25.2％）和較低的KRAS突變頻率（6.8％ vs 27.2％），在肝細胞肝癌中較高的TP53突變頻率（53.1％ vs 28.6％）。高達41.2%的血漿ctDNA樣本檢測到藥物敏感性基因變異，預示著41.2%的癌症患者可從靶向治療中獲益。這些所有的發現可能有助於確定治療靶點和聯合治療的策略。

參考資料：

1.Zhang Yongliang,Yao Yu,Xu Yaping et al. Pan-cancer circulating tumor DNA detection in over 10,000 Chinese patients.[J] .Nat Commun, 2021, 12: 11.

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