基因療法,從不缺新技術|基因療法|細胞|病毒|-健康界

作者丨白頭翁

隨著基因載體的改進、嵌合抗原受體T細胞免疫療法的興起和基因組編輯技術的突破，在過去半個世紀裡，基因療法迅速吸納了幾乎所有生物技術的成果，它為腫瘤和遺傳病等疾病的臨床治療帶來了新的選擇。眾所周知，基因療法往往需要載體的幫助才能將治療性基因輸送到特定的組織和器官中，因此理想的載體是基因療法的關鍵，它一般需要滿足以下幾個特徵：

●有足夠的空間來遞送大片段的治療基因；

●具有高轉導效率，能感染分裂和非分裂的細胞；

●能靶向特定的細胞，且可以長期穩定表達轉基因；

●具有較低的免疫原性或致病性，不會引起炎症；

●具備可大規模生產的能力。

常用的基因治療載體分為病毒載體和非病毒載體兩大類。其中病毒載體運用的比較廣泛，其主要包括逆轉錄病毒（ RV）和慢病毒（ LV）、腺病毒（ Adv）以及腺相關病毒（AAV）等。據統計，已經上市的基因療法產品中，有13款是基於病毒載體的，只有3款是基於非病毒載體的。

然而，病毒載體還存在著諸如插入誘變、致癌，免疫反應和炎症加劇的等等風險。此外，病毒載體的大規模生產存在較高的技術壁壘。

過去基於病毒載體的基因療法也曾發生過一系列的失敗甚至死亡事件，其中最著名的就是1999年美國一位患有嚴重遺傳病鳥氨酸轉氨甲醯酶缺乏症的18歲少年Jesse Gelsinger，在接受賓夕法尼亞大學人類基因治療研究所所長Jim Wilson教授主導的腺病毒基因治療臨床實驗後，因為嚴重免疫反應導致多器官衰竭死亡，成為第一個因基因療法而死的人。

今年1月國際頂級學術期刊《Science》發文報導直指基因治療中所用的AAV病毒有致癌的可能。近期更是有Audentes公司研發的AT132基因產品在短短四個月內，發生了連續3起死亡事件，讓我們不得不停下腳步，冷靜思考基因療法所存在的問題。

病毒載體的缺點，在某種程度上促進了非病毒載體的發展。常見的非病毒載體主要通過物理和化學方法來轉導治療性遺傳物質，包括針，基因槍，電穿孔，聲孔效應，光致成像，磁場轉換，加氫，機械按摩，脂質體，磷酸鈣，二氧化矽和納米粒子等。

非病毒載體具有成本低、製備簡單、便於大規模生產、安全性高、外源基因長度不受限制等優點，但同時也有明顯的缺點，比如轉染效率不理想及外源基因轉導到宿主細胞後表達時間短等。

貝殼社整理了以下幾款基於非病毒載體的基因療法產品，從中可以看出非病毒載體的優勢與不足，供大家參考和了解。

01、Vaxess疫苗

隨著各大公司競相將安全有效的SARS-CoV-2疫苗推向市場，疫苗正在成為所有人關注的焦點。儘管mRNA疫苗相對於病毒顆粒具有易於製造和缺乏感染力的優勢，但仍需要冷藏或冷凍，這給疫苗管理帶來了不小的挑戰。

Vaxess Technologies正在開發一種可以採用MIMIX系統的SARS-CoV-2疫苗，MIMIX系統是一種儲存穩定的單劑量皮膚貼劑，可以極大地改善疫苗管理。雖然其他製劑需要多次注射，但Vaxess疫苗與MIMIX系統的組合只需使用一次，而且皮膚貼劑操作非常簡單，可以在家中使用。

其中，MIMIX使用絲蛋白纖維蛋白來穩定抗原分子，從而使疫苗能夠在室溫下存儲和運輸。 可以對纖維蛋白進行「調節」，以控制疫苗擴散到體內的速度。

MIMIX貼片敷用五分鐘，可以將幾十個絲製尖端嵌入皮膚。移除後，尖端留在皮膚中，在幾周的時間裡，它們逐漸將抗原製劑釋放到體內。

當一種病毒感染人體時，一種強有力的免疫反應會在兩到三周內分階段發展。當病毒複製時，抗原被運送到淋巴結，在那裡相應的T細胞和B細胞被激活。相比之下，人體在一兩天內清除了大部分死亡病毒或蛋白質疫苗。

Vaxess的聯合創始人兼CEO Michael Schrader解釋說：「我們的系統是利用持續釋放來欺騙免疫系統，使他們認為體內確實存在感染，而獲得高質量和大量的抗體和T細胞。通過間隔細胞攝取，用貼片代替藥丸，我們可以潛在地減少細胞死亡的數量。這是一種完美的複合效應，可以產生更強有力的免疫反應，並改善患者體驗。」

02、病毒檢測

針對SARS-CoV-2病毒檢測，Sherlock Biosciences研發了基於結合了一種CRISPR酶Cas13和一種針對SARS-CoV-2 RNA的gRNA檢測試劑盒可對病毒核酸進行靈敏而特異的檢測。首先，用等溫擴增法擴增樣品核糖核酸。然後，引導核糖核酸結合病毒靶序列，激活Cas13酶。一旦酶被激活，Cas13切割添加到反應中的標記核苷酸序列，產生陽性信號。

今年7月，Sherlock宣布了與Binx Health的合作夥伴關係，他將把Sherlock的CRISPR技術與Binx io平臺相結合，能夠同時測試多達24個樣本。

該測試將在各種CLIA豁免的環境中進行，包括藥房，門診和輔助生活設施。Sherlock聯合創始人兼CEO Dhanda指出：「我們已經確定最大的需求領域之一實際上就是分散測試。可以給那些不能去醫院的人或那些不願意去的人提供選擇。」

Sherlock還設想了可以在家裡進行的簡單，無儀器的測試，例如妊娠測試。該測試使用了Sherlock的INSPECTR技術，同時結合了僅在SARS-CoV-2 病毒存在時才被激活的合成生物學傳感器。

03、Oncoprex納米粒子輸送平臺

截至目前，肺癌仍然是一大難攻克的領域，約80%的非小細胞肺癌具有腫瘤抑制基因TUSC2的無功能拷貝。

Genprex是一家臨床階段的基因治療公司，通過Oncoprex納米粒子輸送平臺將帶有TUSC2的質粒包裹在設計成帶正電荷的脂質納米顆粒中送至細胞體內。這些納米顆粒由表面活性劑和膽固醇組成。DOTAP(強陽離子)與膽固醇(電荷中性)的結合產生了一種非常穩定、持久的顆粒，因為納米粒子本身帶正電而被帶負電的癌細胞吸引，納米粒子通過與細胞膜融合，將它們攜帶的核酸釋放到癌細胞中，重新編程癌細胞使其死亡。

Genprex創始人兼CEO Rodney Varner表示:「腫瘤活檢顯示，癌細胞攝取非病毒納米粒子的速度是正常細胞的10至25倍。我們已經用這種系統治療了50多名患者，由此顯示出其良好的安全性。同時它還具有免疫刺激作用。」

TUSC2療法被稱為GPX-001。根據臨床前數據，它與靶向治療和免疫治療都有協同作用。Genprex最近獲得了FDA對GPX-001聯合Tagrisso (osimertinib)的快速認證，這是阿斯利康針對由表皮生長因子受體(EGFR)突變驅動的非小細胞肺癌的靶向治療。GPX-001與Tagrisso的Ⅰ期/Ⅱ期試驗預計將於2021年初開始。該公司還啟動了GPX-001與默克公司的免疫治療藥物Keytruda (pembrolizumab)聯合的Ⅰ期/Ⅱ期試驗。

04、超聲波技術

Suono Bio利用聲波的力量來破壞細胞膜。對於包括小分子藥物，生物製劑和核酸在內的多種藥物，Suono已使用超聲波成功地將所需分子傳遞到細胞中。

Suono的營運長Carl Schoellhammer博士表示：「大多數人都熟悉用於成像的超聲，如果你以比成像更低的頻率使用超聲波，則可以實現遞送。」迄今為止，Suono的重點一直在胃腸道，可提供治療炎症性腸病的藥物。

首先，將含有活性分子的液體引入結腸。超聲波會在液體中產生微小的氣泡，然後氣泡破裂，產生足以使藥物穿過細胞膜的強力射流。整個過程耗時不到一分鐘，與目前的炎症性腸病治療相比，是一個巨大的進步，同時避免患者忍受在等待藥物吸收時數小時的灌腸。

Suono除了提供抗炎小分子藥物外，還使用超聲波技術來傳遞小幹擾RNA（siRNA），從而阻止腫瘤壞死因子TNF-α的產生。Schoellhammer強調：「這是一個完全裸露的RNA，沒有脂質，什麼都沒有。」當科學家向患有結腸炎的小鼠遞送RNA時，TNF-α的水平顯著下降，從而抑制了炎症。用非常低的劑量（不到100 ng的RNA）即可獲得結果，表明該療法可以擴大用於人類。

05、Flowfect

傳統的細胞療法是將DNA插入T細胞，然後進行大量培養，最終再將修飾後的T細胞注入病人體內。對於癌症患者來說，這一治療過程是比較漫長的。

為了加速這一過程，為癌症患者節省大量的時間，基於細胞生物學家已經使用電穿孔技術將DNA或RNA輸送到細胞中的前例。Kytopen開發的一個新系統Flowfect，通過該系統可保持細胞持續流動，減少細胞暴露在電場中的時間，並立即將細胞輸送到回收介質中。

Kytopen聯合創始人兼CEO Paulo A. Garcia博士指出:「通過使用Flowfect系統的電能，我們可以將能量輸送到細胞核，但仍能維持細胞活力和細胞功能。CAR T細胞療法需要大約1億個CAR -T細胞。我們可以以每分鐘10億個細胞的速度處理細胞。」

麻省理工學院機械工程副教授Cullen R. Buie是Flowfect技術的發明者之一，也是Kytopen的創始人之一，他說:「許多系統都有這樣或那樣的局限性。通常，一般都會涉及細胞健康、吞吐量和向細胞核傳遞的權衡。Flowfect系統提供了我們認為是所有這些因素的最佳組合。」

Kytopen已經轉染了一系列細胞類型，包括活化和未活化的T細胞、單核細胞、巨噬細胞和誘導多能幹細胞。此外，幹細胞在轉染後可以保持分化成不同譜系的能力。

從整體來看，非病毒載體具有低免疫原型、低成本、易規模化等優點，因而具有更好的臨床應用前景，但還存在較多未解決的問題，如轉染效率、細胞毒性、靶向性等，因此當前大部分細胞和基因療法項目所採用的載體都為病毒載體，使用非病毒載體的項目大約僅佔項目總數的36.6%。