《高通量測序技術臨床規範化應用北京專家共識(第一版腫瘤部分)》

隨著個體化醫學的發展和"精準醫學"概念的提出，腫瘤藥物治療發展迅速，臨床研究逐漸發現並證實更多與藥物治療療效預測相關的基因突變[1]。傳統的基因突變檢測方法如Sanger測序、焦磷酸測序和實時螢光PCR等僅能對單個基因，或者單個基因的部分外顯子突變進行檢測，採用上述傳統基因突變檢測方法同時檢測多個基因，一則需要的樣本量大，其次需要更長的檢測時間和更大的工作量。高通量測序（HTS）即下一代測序（NGS），能夠同時對上百萬甚至數十億個DNA片段進行測序，可實現在較低的成本下，一次對多至上百個腫瘤相關基因、全外顯子以及全基因組進行檢測，而且需要的樣本量並不增加。因其在通量、成本和效率方面的優勢，NGS在實體腫瘤體細胞基因突變中展現了其廣闊的應用前景[2]。

NGS檢測流程複雜，對實驗室環境條件、人員能力及質量管理要求高。前期，北京市臨床檢驗中心、北京醫學會檢驗醫學分會、首都醫科大學臨床檢驗診斷學系、北京市醫學檢驗質量控制和改進中心牽頭制定了《高通量測序技術臨床檢測規範化應用北京專家共識（第一版通用部分）》（以下簡稱"通用共識"）[3]。實體腫瘤體細胞基因突變NGS檢測中，低頻突變、腫瘤異質性、樣本種類多樣、樣本質量差別較大等均給實驗室檢測帶來了挑戰，因此其在方法建立、分析前、中、後質量控制等方面均有其特殊之處。為規範實體腫瘤體細胞基因突變NGS檢測，在借鑑相關指南、規範及權威發表的文獻基礎上，專家組又起草了《高通量測序技術臨床規範化應用北京專家共識（第一版腫瘤部分）》。本共識中的聲明內容為專家討論並推薦的要點。

一、實體腫瘤體細胞基因突變NGS檢測實驗室建設的總體要求

開展高通量測序臨床檢測的實驗室應依據衛辦醫政發194號文件《醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》，通過省級衛生行政部門相應技術審核和登記備案後，方可開展臨床檢測工作。實驗室環境條件（如通風、溫溼度、潔淨度和防震要求等）、實驗室人員的專業知識和能力、試劑耗材的質檢、儀器設備配備與維護校準等應滿足"通用共識"的要求[3]。

（一）實驗室分區

實驗室分區在滿足"通用共識"要求的基礎上，同時考慮腫瘤基因突變NGS檢測的特點，根據項目、測序平臺、檢測技術流程、樣本類型和樣本量等進行合理設置。實體腫瘤體細胞基因突變檢測通常分析敏感性較高，以單核苷酸變異（SNVs）為例，腫瘤組織和血漿樣本分別能夠檢出突變等位基因百分比低於5%和1%的SNVs，因此開展實體腫瘤體細胞基因突變NGS檢測的實驗室應尤其注意對實驗室進行合理分區，以防止汙染。以雜交捕獲法NGS為例，建議分區考慮以下方面："試劑準備區"是最潔淨的區域，應獨立成區；福馬林固定石蠟包埋（FFPE）樣本需要設置"樣本製備前區"，進行樣本的切片，注意該區域不要與常規病理檢測區域共用；"樣本製備區"用於樣本DNA提取；組織或細胞DNA樣本如通過超聲打斷進行片段化處理，在有條件的情況下建議實驗室單獨設置"打斷區"；DNA片段分析如採用瓊脂糖凝膠電泳，可以單獨設置"電泳區"；"文庫製備區"用於打斷後的DNA加A尾、加接頭、標籤等；"擴增一區"進行文庫的預擴增和純化等；"雜交捕獲區"進行序列的捕獲、富集和純化；"擴增二區"進行文庫的擴增、定量和混合；"測序區"完成高通量測序。

不同檢測流程，其分區設置有所不同，實驗室應根據"通用共識"的"32字原則"來考慮實驗室分區設置。如果實驗室採用多重PCR捕獲，在擴增的同時進行捕獲，則根據檢測流程可以考慮某一擴增區和捕獲區域合併；如果採用的片段化方式是酶消化，則無需設置"打斷區"，可以和"文庫製備區"共用；如果使用生物分析儀對提取核酸進行片段分析，無需單獨設置"電泳區"，可以和"文庫製備區"共用；血漿提取的循環腫瘤DNA（ctDNA）如直接建庫，無需設置"打斷區"。若使用自動化建庫的設備，在確認不產生交叉汙染的前提下，可適當合併某些區域。若實驗室同時開展組織或細胞學樣本基因組DNA和ctDNA檢測時，因為兩類樣本的測序深度及檢測限有較大差別，為避免高濃度組織核酸對低濃度ctDNA的汙染，需要設置不同的樣本製備區和文庫製備過程中所涉及的相關區域。

【共識1】實體腫瘤體細胞突變檢測通常分析敏感性較高，臨床實驗室應尤其注意合理分區，以防止汙染。雜交捕獲法NGS建議的分區包括試劑準備區、樣本製備前區、樣本製備區、打斷區、電泳區、文庫製備區、擴增一區、雜交捕獲區、擴增二區和測序區。但是不同檢測流程，分區設置有所不同，臨床實驗室應根據"通用共識"的"32字原則"來考慮實驗室分區設置。若實驗室同時檢測血漿和組織或細胞學兩類樣本，則需設置不同的樣本製備區及其後續的文庫製備過程中的相應區域。

（二）實驗室人員及能力要求

實驗室應具有可滿足開展檢測要求的相關專業人員，包括實驗室負責人或技術負責人、"溼實驗"的操作人員和"幹實驗"的生物信息學分析人員、遺傳諮詢人員（必要時）和信息系統建立及管理相關人員等，所有人員均需持續接受崗位相關的培訓，並定期進行內部的能力評估[3]。NGS實驗室負責人或技術負責人應有全面的NGS及其實驗室質量管理知識，對所開展的NGS檢測項目及其質量保證關鍵環節具有清晰的認識。"溼實驗"操作人員應具有完成實驗操作的能力，採用組織樣本進行檢測的實驗室，還應包含病理醫（技）師人員，製備組織切片進行HE染色，並能對切片中腫瘤組織的壞死情況、腫瘤細胞的含量和數量進行評估[4]。生物信息學分析人員團隊除需熟練掌握腫瘤基因突變NGS檢測原理及常用軟體外，還應配備具有臨床腫瘤學和臨床分子檢測基本知識的人員。籤發報告人員應具備醫學分子生物學和臨床腫瘤學知識背景，能夠熟練使用腫瘤基因相關資料庫，掌握相關臨床診療指南，了解腫瘤靶向和免疫治療藥物及其相關腫瘤基因突變研究的最新進展。對於疑難病例或必要時，可由相關臨床醫生、病理醫生、影像醫生、醫學遺傳學家、腫瘤突變分子檢測人員、相關的實驗室其他人員、相關藥師等來自不同專業的專家組成分子腫瘤專家組（MTB），依據基因突變檢測結果，結合患者狀況、臨床表現、病理和影像學檢查結果等，經充分討論後，給出合理的個體化精準治療方案[5]。使用實驗室自建檢測（LDTs）的實驗室，應配備"溼實驗"和"幹實驗"研發人員，具備"溼實驗"和"幹實驗"方法建立、優化和性能確認的能力。其中生物信息學分析人員具有搭建序列比對、突變過濾、臨床意義及靶向用藥類、突變注釋類以及本實驗室內腫瘤基因突變臨床有效性等的資料庫的能力。

【共識2】NGS實驗室負責人或技術負責人應有全面的NGS及其實驗室質量管理知識。採用組織樣本進行檢測的實驗室，"溼實驗"團隊成員應包括病理醫（技）師人員。生物信息學分析團隊中應有具備臨床腫瘤學和臨床分子檢測基本知識的人員。籤發報告人員應具備醫學分子生物學和臨床腫瘤學知識背景，熟練使用相關資料庫，掌握本領域的指南，了解相關研究的最新進展。對於疑難病例或必要時，可由不同專業的專家組成的分子腫瘤專家組給出個體化治療方案。使用LDTs的實驗室，應配備"溼實驗"和"幹實驗"研發人員，其應具有正確設定腫瘤體細胞突變NGS檢測臨床預期用途、建立檢測系統（含試劑配製和生物信息分析流程搭建等）及其使用SOPs以及完成LDTs性能確認的能力。

二、腫瘤基因突變NGS檢測流程的建立與質量保證

實驗室可選擇國家藥品監督管理局（NMPA）批准的試劑盒，使用前應進行分析性能驗證；如沒有可用的批准試劑，或對批准試劑根據研究及臨床診療指南進展進行了修改，即可設計建立LDTs。使用LDTs進行NGS檢測的實驗室，在建立檢測流程前，應首先明確擬開展的NGS檢測項目的臨床預期用途，確定合適的檢測基因及其突變[6-7]，建立並優化"溼實驗"和"幹實驗"分析流程，並對測序平臺、生物信息學分析流程分別進行性能確認，最後對檢測方法進行全面的分析性能確認和一定的臨床性能確認（適用時）[8-9]。

（一）臨床預期用途

檢測項目必須基於醫學科學證據，有明確的臨床預期用途。實體腫瘤體細胞基因突變NGS檢測的臨床預期用途是用於藥物療效預測，即通過體細胞基因突變檢測選擇可能在靶向或免疫治療藥物中受益的患者以及監測耐藥的出現[10]。臨床預期用途的敘述中應包括但不限於適用人群、樣本類型、檢測基因及其突變位點或突變類型和檢測的臨床意義[7]。原則上，建議選擇醫學科學證據支持的、臨床意義明確或有潛在臨床意義的基因進行檢測。如果檢測的臨床意義是伴隨診斷，預期用途中必須明確伴隨診斷的藥物和每種藥物對應的實體腫瘤患者人群。如果是非伴隨診斷，預期用途中必須說明檢測項目為非伴隨診斷，由臨床醫生根據相應的疾病診療指南選擇治療藥物。

（二）NGS方法學建立及其關鍵環節的優化

實體腫瘤體細胞基因突變NGS檢測方法的建立與優化涉及分析前的樣本採集、運送、保存及處理；分析中的"溼實驗"（引物或探針設計及合成、核酸提取、文庫製備、上機測序）和"幹實驗"即生物信息學分析流程等檢測全過程；分析後的結果報告及解讀、信息貯存及傳遞和保密（實驗室信息管理系統）以及臨床有效性數據的收集等。此外，實驗室需設計體細胞基因突變的識別策略，無論是否採用腫瘤組織與該患者正常組織或白細胞進行配對檢測，都需要確認檢測方法是否能有效區分體細胞突變和胚系突變。

1．待測基因位點的選擇：需根據檢測目的，依據醫學科學證據選擇待測基因位點。如美國FDA根據基因位點的臨床意義等級將腫瘤基因突變NGS檢測分為3個等級[11-12]：第一級為腫瘤的伴隨診斷（CDx），為安全有效使用治療藥物所進行的必要檢測，所測的基因位點具有明確的分析有效性和臨床有效性，如EGFR、ALK、BRAF突變檢測；第二級為專業指南推薦的具有顯著臨床意義的基因位點，其分析有效性和臨床有效性可通過臨床試驗、指南或已發表的文獻證實，如用於腫瘤突變負荷（TMB）和微衛星不穩定性（MSI）的檢測；第三級為除第一、二級以外的，具有潛在臨床價值的基因位點，已有基礎或臨床研究顯示其臨床意義，此類檢測有可能用於臨床試驗受試者的篩選。檢測基因盤（以下簡稱panel）的大小決定了測序成本、實驗室檢測工作量以及分析和臨床解釋的複雜性，實驗室應合理選擇基因和panel大小。如用於指導初診患者用藥治療時，可選用第一級的基因位點，檢測panel較小；靶向治療耐藥監測或免疫治療療效預測，則可設計泛癌種的panel，選擇包括第一級、第二級和第三級的基因位點，檢測panel通常較大[13-14]。

NGS檢測的基因突變類型包括SNVs、小的缺失和插入、拷貝數變異（CNAs）、結構變異（SVs）如基因融合[14]。實驗室應根據擬檢測的基因突變類型和位點，確定基因panel內每個基因的覆蓋範圍，如擬檢測整個基因水平上的CNAs時，需要覆蓋所有外顯子區域，甚至向非編碼區延伸以保證準確性；若檢測基因融合時，可選擇雜交捕獲的方法進行DNA測序或是RNA測序，融合基因的斷點位置通常位於非編碼區域，並且很少具有聚集性，若使用DNA測序，檢測panel需要覆蓋最常見的內含子/外顯子、或者整個基因[14]。微衛星（MS）是遍布人類基因組中的短串聯重複序列，由1~6個鹼基的序列重複構成[15]，在探針設計時可優先考慮單鹼基重複，如果單鹼基重複不佳，可對雙/多鹼基單元重複進行嚴格篩選後納入[16]。用於檢測MSI的panel，需要保證有足夠的MS位點數，目前文獻報導的MS位點數已達到數千個[17-19]。在對TMB進行檢測時，最理想的方法是全外顯子測序[20]，也可使用靶向測序，測序panel的大小影響TMB檢測的準確性，文獻報導panel大小位於1 Mb~39 Mb之間[21]，檢測前應利用全外顯子測序的數據對panel的編碼區範圍進行TMB分析的飽和度評估[22]。使用擴增子法進行建庫時還需要重點考慮引物的擴增效率、擴增子密度等，以保證檢測的重複性和再現性。

2．核酸提取的建立和優化：實驗室需根據待檢樣本類型選擇核酸提取試劑，不同樣本類型對核酸提取試劑要求不同，實驗室可使用商業化的提取試劑盒、設備或已經過確認的自建核酸提取方法。使用前，應對擬採用的試劑或設備進行評估，評估是否適用擬檢測的癌種和樣本類型。如腫瘤患者血漿樣本中含有的游離DNA以主峰在140~170 bp的小片段為主，而且濃度很低，與組織和細胞樣本中提取的人基因組DNA有很大不同。因此，實驗室需確認核酸提取的重複性、提取效率、提取純度及不同大小核酸片段提取的偏好性（必要時）等方面。

NGS檢測所需的核酸量與測序平臺、panel大小以及文庫富集方法有關[23]，核酸質量是決定檢測成功的關鍵因素。使用FFPE提取DNA時，若FFPE保存年限過長，DNA中胞嘧啶脫氨基轉變為尿嘧啶，PCR擴增後C>T現象較為嚴重，可以通過尿嘧啶DNA糖基酶（UNG酶）或5-甲基胞嘧啶DNA糖基化酶（5-methylcytosine DNA glycosylase）處理DNA以降低檢測的背景噪音[14]。使用血漿樣本進行ctDNA提取，可通過PCR法分析ctDNA的片段分布，來監測是否受到基因組DNA的"汙染"[24]。

3．文庫製備的建立和優化：文庫製備步驟較多，接頭與樣本DNA片段的連接效率、PCR反應體系（聚合酶、引物、緩衝液和擴增反應條件等）均可能影響文庫的質量，此外，實驗室還可在PCR擴增前，使用特異分子標籤（UMIs或UMD）標記技術，以便於準確識別天然重複序列，區分低頻突變和檢測過程中引入的錯誤[25-26]。實驗室需確認文庫製備流程可以產生滿足檢測要求的文庫（文庫濃度、文庫片段大小等），評估交叉汙染發生率，必要時通過特異雙端標籤建庫策略以及合適的生物信息學分析流程降低汙染[27]。

4．測序平臺的性能確認：實驗室應優先選擇NMPA批准的測序平臺，並根據所選定的基因panel，並綜合考慮測序通量、測序數據準確度、可支持讀長、運行時間、測序成本等選擇測序平臺型號。對已知不同突變類型的樣本進行檢測，建立測序平臺檢測不同突變類型的性能指標（如精密度、準確度），並明確所用測序平臺是否滿足臨床預期用途[9,13]。

5．生物信息學分析流程的搭建與性能確認：在生物信息學分析流程搭建和優化過程中，實驗室應確定測序深度和陽性判斷值（cut-off）。測序深度和陽性判斷值密切相關，即適宜的測序深度需在已知陽性判斷值的前提下方可確定；而合理的陽性判斷值也需在一定的測序深度條件下明確。實驗室應根據所檢測的突變類型，選擇合適的算法和軟體，提高對腫瘤基因突變檢測的敏感性。不同軟體或算法識別某種變異類型的能力有所不同，應採用多種算法，以提高不同突變類型的檢出準確率[28]。另外還應建立完善包括數據質控與過濾、數據比對、變異識別和變異注釋在內的生物信息學數據分析流程、軟體及資料庫[29]。

生物信息學分析流程建立後，實驗室應對其進行性能確認，並建立數據分析質量標準，包括但不限於最低測序深度、平均測序深度、覆蓋均一性、GC含量、鹼基識別質量值、比對質量值和在靶率等。（1）測序深度：測序深度與擬定的基因panel臨床預期用途、文庫的複雜性和測序成本等因素相關[30]。實驗室可根據相關文獻、統計學方法（如功效分析、二項式分布）或工作經驗，估算測序深度[14,31]。也可先用較高的測序深度進行測序，通過數據抽樣，分析部分原始測序數據來模擬不同的測序深度[32]。通過分析在不同測序深度條件下，不同突變頻率（包括檢測限）的陽性樣本檢出率而確定。（2）陽性判斷值：陽性判斷值用於區分陰陽性結果，實驗室應清楚證明陽性判斷值設定的依據。如果實驗室檢測不同突變類型，則需要分別說明每一種突變類型陽性判斷值設定的依據。有文獻通過檢測一定數量的陰性臨床樣本（如FFPE樣本）或正常細胞系（如HapMap細胞系NA12878），統計分析各個基因位點的reads數和標準差，並以reads數加上3倍的標準差作為暫定的陽性判斷值[33]。也有文獻報導通過檢測一定數量的陰性和陽性樣本，採用統計學方法如ROC曲線或PR（precision-recall）曲線來確定合適的陽性判斷值[30,34]。

當生物信息學分析流程經過上述過程建立完成後，需對其進行性能確認以進一步優化。性能確認的樣本可為：（1）臨床樣本的測序數據。對臨床樣本進行NGS全流程檢測後得到的測序數據是最重要的性能確認樣本；（2）計算機模擬的測序數據。如通過Varsim、BAMSurgeon或Mutationmaker等軟體對已有樣本的測序數據再編輯後產生的測序數據；（3）參考物質（如Hapmap的細胞系NA12878、NA19240、NA18507或商品化參考物質）的測序數據。計算機模擬和參考物質的測序數據只能作為補充數據，不能完全替代臨床樣本測序數據[35]。性能確認的指標包括精密度、準確度、分析敏感性、分析特異性和可報告範圍等[35]。

【共識3】實體腫瘤體細胞基因突變NGS檢測的臨床預期用途為通過體細胞基因突變檢測選擇可能在靶向或免疫治療藥物使用中受益的患者以及耐藥監測。臨床實驗室應在預期用途中包括但不限於適用人群、樣本類型、檢測基因及其突變位點或突變類型和檢測的臨床意義等。在NGS方法學建立和優化階段，實驗室需根據臨床預期用途，選擇具有臨床意義的待測基因位點；優化核酸提取方法，所提取核酸的質量應滿足檢測要求；建立和優化文庫製備方法；對測序平臺進行性能確認，建立測序平臺檢測不同突變類型的性能指標；搭建和優化生物信息學分析流程，確定測序深度和陽性判斷值，並對生物信息學分析流程進行性能確認。

（三）性能驗證或性能確認

如果NMPA批准試劑可以滿足實驗室擬開展檢測項目的臨床預期用途，則實驗室應優先選擇NMPA批准試劑。實驗室使用已批准的NGS試劑開展臨床檢測服務前，必須進行性能驗證。如果實驗室改變已批准試劑指定的預期用途、試劑組分、操作流程，則按照LDTs試劑要求進行管理。如所用試劑為LDTs，在臨床檢測前需進行檢測系統（包含人、機、料、法、環等）的分析性能確認[8]。實驗室應通過試劑方法建立和性能確認的過程，建立及完善檢測系統，明確日常檢測質量控制標準及關鍵點，形成檢測操作全過程說明書（即分析前、分析中和分析後SOPs），建立試劑的分析性能指標以及明確檢測局限性。以下將分析性能確認和分析性能驗證統稱分析性能評價。

進行分析性能評價的指標至少應包括精密度、準確度、分析敏感性、分析特異性（包括幹擾物質）、可報告範圍[36]。其中，精密度是指同一樣本在多次檢測中結果的一致程度，包括重複性和再現性兩個方面。重複性指在同一條件下（相同環境、相同操作人員、相同檢測流程、相同儀器）進行多次測量同一序列，測定結果的一致程度。再現性指由不同操作人員、不同儀器（相同型號）和不同批試劑進行同一序列測量結果的一致性程度[6]。準確性指測定檢出的序列與參考序列的一致性程度。對準確性的評價可通過兩部分進行。一是通過檢測已知序列的人基因組DNA（如標準細胞株），來評價測序本身的準確性。如果為疾病相關的多基因或全外顯子測序，可只評價靶向區域的測序結果。測序的準確性可通過鹼基的正確率來表示；二是通過檢測臨床樣本進行驗證，包括含有疾病相關突變的樣本和含有與待檢突變相同突變類型的樣本，評價範圍應包括具有明確臨床意義的位點，較難測序或比對的區域、不同GC含量的區域等[6,14]。可將NGS與另一已經過確認的方法同時檢測臨床樣本來評價，比較NGS與另一方法之間結果的差異，不一致的結果再用第三種方法進一步確認，通過陽性符合率（PPA）和陰性符合率（NPA）來評價定性測定的準確度[14]。檢測點突變、短片段缺失和短片段插入的比較方法可以採用Sanger測序、等位基因特異性PCR等；檢測拷貝數變異的比較方法，可以採用實時螢光定量PCR、螢光原位雜交（FISH）等；基因融合可以採用FISH、實時螢光PCR等方法作為NGS檢測的比較方法。分析敏感性，這裡指LoD，通常使用LoD95%表示，即有95%的可能性能夠正確檢出突變位點的最低等位基因百分比[8]。通常採用已知突變等位基因百分比的樣本，用另一基因組DNA（或游離DNA）混合稀釋來進行評價。實驗室需建立不同突變類型和不同樣本類型的LoD95%。分析特異性是評價樣本中的同源序列或其他交叉反應的序列和內源及外源幹擾物質對檢測結果的影響[6,37-39]。幹擾物質即可能對檢測結果產生影響的物質，內源性的如黑色素、血紅蛋白等；外源性的如標本處理過程中加入的乙醇、蛋白酶K、加入的標籤等。此外，在準確性確認中，可部分確認可報告範圍，實驗室在日常檢測中，應對可報告範圍持續關注和確認。

用於性能評價的樣本最理想的是與檢測範圍內腫瘤類型、樣本類型和組織來源相同的臨床樣本[40]。特別是預期將來臨床應用檢測的樣本類型，是最佳的選擇。如果臨床實驗室可接受多個樣本類型，那麼對每種樣本類型均需分別進行性能確認。未經分析性能評價的樣本類型應被視為無法準確檢出的樣本。沒有足夠的、能代表各種突變類型、並且有適合濃度的臨床樣本，可以使用類似的模擬樣本來代替。如FFPE樣本可以部分使用細胞系或人基因組DNA樣本；如血漿樣本可以使用模擬游離DNA樣本等；但不能完全代替臨床樣本[41]。實驗室可通過福馬林固定和石蠟包埋，將細胞系製備成FFPE樣本以模擬臨床樣本[14,42]。

對每種突變類型或樣本類型進行分析性能確認時，所用的樣本量需達到統計學意義。有文獻建議進行精密度性能確認時至少需3例樣本，進行準確性評價時應至少檢測59例樣本，進行LoD95%評價時至少需要進行60次檢測，若無法獲得足夠的檢測次數，則應在後續臨床檢測中設置弱陽性質控，以保證能準確檢測位於LoD的突變[14,43]。檢測FFPE樣本時，由於DNA質量可能不高，實驗室需增加性能確認的樣本量，以保證低質量樣本檢測結果的可靠性[14]。若某種突變類型（如大片段的缺失、結構變異、拷貝數變異等）的樣本不易獲得，實驗室無法短時間內獲得足夠的樣本進行性能確認，則應按NGS無法準確檢出的位點對待，需使用其他方法（如PCR法、Sanger測序法或雜交晶片法等）對這類位點的陽性結果進行確認，或在NGS的檢測報告中註明檢測的局限性[14]。

分析性能確認需明確分析前、分析中、分析後涉及影響檢測結果的關鍵質量控制參數如腫瘤細胞含量、文庫構建所需的DNA量、文庫片段分布、文庫濃度、最低測序深度、平均測序深度、覆蓋均一性、符合要求質量值的鹼基百分比（如Q30百分比）等及檢測的局限性，最終完成建立"溼實驗"試劑配製和"幹實驗"生物信息學分析流程SOPs，包括採血管（如適用）、核酸提取試劑、合成相應的引物探針、文庫製備試劑、通用測序反應試劑、儀器、質控品、軟體/算法及其版本、分析參數、質量標準、資料庫等。所有日常檢測中均需全員嚴格遵循，不得隨意改變。若試劑、軟體及其版本、參數和資料庫發生改變，實驗室應根據影響程度進行全流程或部分檢測環節的重新分析性能確認。實驗室在進行分析性能確認過程中，若發現重要區域的測序質量值無法達到預定的可接受範圍，實驗室需繼續修改、優化檢測體系，或是將其從可報告範圍中刪除[40]。對於預期用途為伴隨診斷的NGS檢測，還需進行臨床性能確認和臨床有用性評價[41]。臨床性能確認的指標包括適用人群中的臨床敏感性、臨床特異性[44-45]。實驗室需結合預期用途和患者臨床資料（如病理檢查、影像學檢查或臨床發現）進行臨床性能確認指標分析[41]。單個實驗室若無法通過本實驗室的檢測樣本統計臨床性能指標，可以通過檢測無疾病人群獲得臨床特異性的指標。此外，還可以根據相關文獻，建立臨床性能指標[41,46]。

【共識4】使用NMPA批准的NGS試劑進行檢測前應進行分析性能驗證；LDTs試劑應根據臨床預期用途進行試劑方法的設計和優化，至少要對體細胞基因突變的識別策略、樣本前處理、核酸提取、文庫製備、靶向捕獲、高通量測序平臺、生物信息學分析、測序深度和陽性判斷值等環節進行確認。在完成試劑方法的設計和優化後，實驗室應對LDTs檢測的全流程進行整體的性能確認。分析性能確認應至少證明NGS對各種不同突變類型的檢測能力，證明對重要常見基因的檢測能力。如果臨床實驗室可接收多個樣本類型，那麼對每種樣本類型均需分別進行性能確認。沒有足夠的臨床樣本，可以使用模擬樣本來代替。分析性能確認包括但不限於精密度、準確度、分析敏感性、分析特異性和可報告範圍等。在確認分析性能特徵可以滿足臨床預期用途後，最終完成建立"溼實驗"試劑配製和"幹實驗"生物信息學分析流程SOPs。對預期用途為伴隨診斷的NGS檢測需進行臨床性能確認。性能評價應包含檢測範圍內樣本類型和突變類型。通過性能評價，建立性能參數，明確檢測的局限性。若實驗室流程發生改動，需根據對檢測的影響進行全面或部分性能確認。

三、實驗室檢測SOPs的建立

實驗室應對檢測操作全過程建立具有可操作性的SOPs，並在日常檢測中對檢測全流程進行記錄，以保證檢測結果具有可追溯性。

（一）分析前

在分析前階段，為保證臨床醫生能為患者開具正確的檢測申請單以及採集到符合質量要求的樣本，實驗室需提前告知臨床醫生有關NGS檢測的臨床預期用途和適用症、檢測方法及其性能、檢測的局限性、樣本採集運輸和預處理的注意事項以及報告周轉時間等。臨床醫生應為患者提供必要的分析前諮詢，使其知情同意。為能使實驗室對檢測申請單的合理性進行審核，送檢申請單應包含必要的信息，包括採樣相關信息（包括樣本類型、採樣部位、採樣時間等）和相關的臨床信息（包括疾病診斷、疾病分期分型、治療情況）等[46]。此外，實驗室還需建立分析前質量指標（如樣本不合格率、樣本容器錯誤率、檢測申請單錯誤率等），監控分析前關鍵環節的質量[47]。

可用於實體腫瘤體細胞基因突變檢測的樣本類型包括FFPE樣本、新鮮組織、血漿、胸腹水等。實驗室應對樣本的採集容器、採樣量、保存及運送條件、預處理方式等進行確認，保證樣本質量，避免交叉汙染。應制定樣本採集SOPs，明確樣本接收和拒收標準，建立合適的樣本運輸和保存要求。對於不滿足樣本接收標準，無法重新取樣，但又有檢測需求的特定樣本，可在實驗室主任或相關負責人同意以及與臨床醫生充分溝通並同意的情況下，實施讓步檢測，並在結果報告中進行風險提示和免責聲明。

1．FFPE：為保證核酸的質量，手術或活檢組織應在離體10 min內浸入10%中性福馬林固定液中進行固定，固定時間為6~48 h[48]。組織固定後石蠟包埋並連續切片，建議切片厚度4~5 μm。對其中1張FFPE切片進行HE染色，並在顯微鏡下觀察腫瘤細胞的含量和數量。若腫瘤細胞含量不足，實驗室可標記腫瘤細胞區域並富集腫瘤細胞。需要注意的是，腫瘤細胞含量與數量的評估易受到觀察者主觀因素的影響[49]。為避免樣本處理帶來的交叉汙染，切片製備過程中，應使用一次性耗材（如切片的刀片、挑切下蠟片的棉籤或毛筆等），並在每個樣本操作完成後及時清理切片機並保證每個樣本的切片有單獨展片水缸，每個患者的FFPE樣本應單獨脫蠟[50-51]。FFPE樣本可常溫運輸和保存，為防止樣本之間的交叉汙染，應保證"一盒一樣"。強酸處理的脫鈣組織DNA損傷嚴重，不適合NGS檢測。實驗室可用弱酸進行骨組織脫鈣，但需對脫鈣時間和脫鈣方法進行驗證，保證提取核酸的質量滿足要求[52]。

2．新鮮組織：新鮮組織（包括手術和活檢組織）可提取得到高質量的核酸。新鮮組織應在離體後30 min內置於液氮中，進行快速病理切片，以評估腫瘤細胞的含量[50]。若腫瘤細胞含量不足，可通過標記腫瘤區域進行富集[53]。新鮮冰凍組織可於液氮、-70℃冰箱或穩定劑中長期保存[50]。

3．血漿樣本：血漿樣本採集、運送、接收和保存的核心是避免外周血有核細胞裂解釋放基因組DNA稀釋游離DNA和游離DNA降解。可使用血漿游離DNA專用採血管或EDTA抗凝管採集外周血。不同採血管的樣本保存溫度及保存時間不同[24,54]。血漿游離DNA專用採血管可參考廠家建議。採集血液樣本時應注意避免溶血，EDTA抗凝管採集樣本後需要對血液樣本進行血漿分離處理，以避免ctDNA降解或外周血有核細胞裂解釋放基因組DNA稀釋ctDNA[24]。建議進行兩次離心，第一次為1 600×g離心10 min，第二次為16 000×g離心10 min。血漿分離最好在採集後6 h內完成。運輸過程中需避免血液樣本發生劇烈振蕩。血漿分離後，如果不能立即進行游離DNA提取，可在-20 ℃可保存1個月，長期保存應置於-70 ℃[55]，避免反覆凍融。如果可以提取，可暫時在4℃保存3 h。ctDNA的含量與腫瘤類型、腫瘤分期、採樣時間和臨床治療等有關[56-57]。實驗室應制定ctDNA檢測的臨床適應證[58]。

4．胸腔積液及腹腔積液樣本：臨床上可採用胸腔積液及腹腔積液上清或離心後得到的細胞沉澱進行NGS檢測。使用細胞沉澱檢測前，應先製成蠟塊，進行切片和HE染色，鏡檢確認腫瘤細胞含量[23]。不同的樣本類型（上清或細胞沉澱）所需的樣本採集容器不同，實驗室應制定適宜的保存條件[50]。

【共識5】實驗室應制定每一種類型樣本採集、運送、接收和保存的SOPs，明確樣本接收和拒收標準，建立合適的樣本運輸和保存要求。適用於腫瘤基因突變NGS檢測的樣本主要包括FFPE、血漿、新鮮組織、胸腹水等。採用FFPE、胸腹水細胞沉澱或新鮮組織進行NGS檢測前，需先評估樣本質量和腫瘤細胞的含量。為避免交叉汙染，切片製備過程中，應使用一次性耗材。血漿樣本採集、運送、接收和保存的核心是避免外周血有核細胞裂解釋放基因組DNA稀釋游離DNA或游離DNA降解。分析前記錄的關鍵點為樣本接收、拒收和預處理的記錄。當樣本質量未達到SOPs要求時，可進行讓步檢測，但應建立對應的異常情況處理程序。

（二）分析中

實驗室應根據性能確認或性能驗證的結果，建立分析中檢測的標準操作程序。各環節的質量標準是標準操作程序的重要組成，包括核酸提取後，核酸濃度、核酸純度和核酸的片段分布要求，文庫製備的DNA上樣量和文庫製備後進行雜交捕獲上樣量的要求，最低測序深度、平均測序深度、覆蓋均一性、GC含量、鹼基識別質量值、比對質量值和在靶率等要求[41]。這些要求也同時是分析中實驗記錄的關鍵點。當上述質量標準要求未達到時，可進行讓步檢測，但應建立對應的異常情況處理程序。

實驗室應建立室內質量控制的標準操作程序。室內質控品應儘可能涵蓋檢測範圍內的所有樣本類型和突變類型。臨床樣本是最理想的質控品，但特定標誌物的陽性標本常常難以獲得，因此腫瘤體細胞突變NGS檢測多採用模擬樣本作為質控品。模擬樣本的分析物生物特徵和基質應儘可能與臨床樣本一致。如可將細胞系進行福馬林固定石蠟包埋，模擬FFPE樣本；採用核小體特異切割位點的機制，形成腫瘤游離DNA核小體單體大小為主的片段分布特徵，以模擬血漿中的ctDNA[59]。自製質控品應有質控品製備和驗證的程序和記錄。單個質控品可能無法覆蓋檢測範圍內的所有突變位點或突變類型，實驗室可輪換使用多個含有不同突變類型的質控品。質控品的設置應至少包含弱陽性、陰性和無模板對照（如水樣本），且與待檢樣本同批檢測。質控標準至少應符合以下要求：如果弱陽性質控品未檢出，判為失控；陰性質控品檢出陽性，判為失控。無模板對照中應包含在所有的擴增步驟中，如在文庫質控環節中出現目的片段，說明檢測操作過程中出現了核酸的交叉或遺留汙染，判為失控。出現失控，應分析失控原因，並採取相應的糾正措施和預防措施。實驗室還可階段性統計核酸提取不合格率、文庫構建不合格率、下機數據質控不合格率、測序深度不合格率、覆蓋均一性不合格率、汙染率、各體細胞突變位點陽性率等，動態監測統計日常檢測樣本和室內質控數據，觀察變化以進行改善。DNA質量、文庫質量或測序質量不合格時，實驗室應建立異常情況處理程序（如讓步檢測、確認檢測或不發出檢測報告）。

實驗室應定期參加室間質量評價（EQA）或能力驗證（PT）。如使用腫瘤/正常雙樣本配對檢測腫瘤基因突變的實驗室，應儘量選擇雙樣本配對的EQA/PT項目。具體要求可參考"通用共識"[3]。

【共識6】實驗室應根據性能確認或性能驗證的結果，建立分析中檢測的標準操作程序。各環節的質量標準是標準操作程序的重要組成，包括核酸提取後，核酸濃度、核酸純度和核酸的片段分布要求，文庫製備的DNA上樣量和文庫製備後進行雜交捕獲上樣量的要求，最低測序深度、平均測序深度、覆蓋均一性、GC含量、鹼基識別質量值、比對質量值和在靶率等要求，這些要求也同時是分析中實驗記錄的關鍵點。若某一關鍵環節的檢測質量控制參數不符合要求，則實驗室應根據所建立的異常情況的處理程序進行處理。此外，實驗室應根據可檢測的樣本類型、突變類型、檢測下限等設置合適的包括所檢測的所有突變類型的弱陽性、陰性和無模板對照（如水樣本）質控品，且與待檢樣本同批檢測。定期參加EQA/PT或進行實驗室間比對等。出現失控，應分析失控原因，並採取相應的糾正措施和預防措施。

（三）分析後

1．基本信息：腫瘤體細胞基因突變NGS檢測結果報告的要素見"通用共識"[3]。樣本信息中需註明病理診斷（如腫瘤組織部位、組織類型等）、腫瘤細胞的百分比和數量（適用時）、其他影響樣本質量的因素（如出血、壞死、是否強酸脫鈣處理）等。因方法對檢測性能影響較大，實驗室應對腫瘤體細胞基因突變NGS檢測方法進行詳細說明，包括：（1）方法名稱：例如靶向測序、全外顯子測序、全基因組測序；（2）檢測平臺：即使用的高通量測序儀名稱；（3）目標區域富集方法：例如多重PCR、雜交捕獲等；（4）檢測範圍：包括實驗室需要在結果報告單上註明檢測的基因、可檢測的突變類型或者具體的腫瘤熱點突變，如果突變位點很多，可以給予網址連結，以便查詢；（5）生物信息學分析：重要的參數，如測序深度，不符合要求的區域需要說明；（6）檢測性能和局限性：檢測限等重要的性能指標需進行說明。檢測方法的局限性也應當進行說明。如腫瘤游離DNA體細胞突變檢測用於藥物療效預測，特異性較高，但臨床敏感性較差，NCCN指南建議如果血漿T790M檢測結果為陰性，仍需進行組織學檢測；（7）確認實驗：如果檢測採用第二種方法確認，需在結果報告單對該方法進行說明。

2．結果報告：實體腫瘤體細胞基因突變可參考HUGO基因命名委員會（HGNC）、人類基因組變異學會（HGVS）等建議進行報告[41]；還應提供與檢出的腫瘤基因突變相關的推薦藥物、藥物的證據等級、變異的臨床意義分級及相關詳細證據來源，對於在研臨床藥物應給出臨床試驗開展狀態、患者入組條件及聯繫方式等相關信息。突變的臨床意義可依據腫瘤特異性公共資料庫（如COSMIC、cBioPortal、My Cancer Genome、Personalized Cancer Therapy、Clinical interpretations of variants in cancer、oncoKB等）、臨床試驗資料庫（如ClinicalTrials.gov、中國臨床試驗註冊中心、EudraCT等）及腫瘤相關指南（如NCCN指南、ESMO指南、CSCO指南等）進行注釋[60]。綜合伴隨診斷、臨床指南、資料庫或文獻證據，可以將腫瘤體細胞基因突變分為臨床意義明確（Ⅰ級）、有潛在臨床意義（Ⅱ級）、臨床意義不明確（Ⅲ級）和良性或可能良性突變（Ⅳ級）。實驗室需要建立分類及分級和報告的SOPs，SOPs應至少包括兩個方面：（1）對體細胞基因突變進行分級的流程；（2）在日常檢測中報告哪一級或哪幾級突變位點。分級的流程應有記錄，包括證據來源的指南、文獻、資料庫、證據等級、分級結果等。臨床證據決定突變位點分級，證據通常包括以下4級[61]（表1）：（1）等級A：美國FDA批准靶向治療藥物相關突變位點（特定腫瘤）或者是臨床診療指南中治療、診斷或者預後判斷相關突變位點（特定腫瘤）；（2）等級B：基於證據充分臨床研究基礎上專家共識認為與靶向治療、某一疾病診斷或者預後相關的突變位點；（3）等級C：美國FDA批准靶向治療藥物相關突變位點（不同腫瘤）或者是臨床診療指南中治療、診斷或者預後判斷相關突變位點（不同腫瘤），即非適應證的用藥，臨床試驗的入組標準或者基於多個小規模研究表明具有指導診斷和預後判斷的意義；（4）等級D：臨床前研究表明可能有治療指導意義，或者在小規模研究、多個病例報導（非共識）中表明該突變（或者和其他標誌物聯合）具有指導診斷和預後判斷的意義。實驗室應根據相關要求制定腫瘤基因突變檢測結果報告的程序文件，其中Ⅰ級和Ⅱ級突變需要明確報告[44,61-62]。腫瘤基因突變檢測報告除了報告陽性變異位點外，對於特定腫瘤中的A級陰性結果也應予以標註[61]。報告中應註明所用資料庫的版本號，並對資料庫的局限性進行說明。實驗室需定期更新完善資料庫，並對資料庫的更新迭代做好記錄，以便結果的回溯[61]。

【共識7】腫瘤體細胞基因突變NGS檢測結果報告應對檢測方法進行詳細說明。腫瘤體細胞基因突變可以分為臨床意義明確、有潛在臨床意義、臨床意義不明確和良性或可能良性突變四級，臨床證據等級有A、B、C和D級。實驗室需要建立分級和報告的SOPs，明確對體細胞基因突變進行分級的流程和在日常檢測中報告哪一級或哪幾級突變位點。分級的流程應有記錄，包括證據來源的指南、文獻、資料庫，證據等級，分級結果等。

3．結果解釋：實驗室應對體細胞基因突變的意義進行解釋，本共識僅涉及藥物療效預測的臨床意義。實驗室應制定結果解釋的SOPs，SOPs應遵循以下原則：（1）準確：實驗室提供的藥物應該是有依據的，而且藥物推薦的證據應該在報告單中註明。（2）及時：實驗室應當依據最新的證據（包括指南、文獻和資料庫等）進行藥物解讀，因為證據是不斷變化的。（3）充分：實驗室在臨床需要的情況下，應該儘可能提供全面的信息、證據和解讀。實驗室應在和臨床溝通後，確定實驗室報告何種臨床證據等級的藥物，並制定SOPs。如實驗室日常報告伴隨診斷和臨床指南推薦的藥物，那麼在報告解讀時，應對該等級的藥物進行全面的推薦。

4．實驗室的建議和說明：在需要的情況下，臨床實驗室應給出進一步檢測的建議。例如FFPE樣本有些核酸降解或者片段化嚴重，核酸提取的量低，導致檢測結果中內控陰性，或者文庫構建失敗；又如血漿中游離DNA檢測時，有些樣本DNA含量偏低，這些樣本的問題只有在檢測過程中才能夠發現。這種情況下，實驗室可要求臨床重新採集樣本；如果樣本來源受限，例如組織樣本無法重新採集，可建議進行細胞學檢測或者血漿游離DNA檢測。由於樣本質量或其他質量要求未達到，但樣本有限的情況進行的讓步檢測，也應在報告中進行說明。

在進行腫瘤基因突變NGS檢測時，可能會出現意外發現。國際上對於是否報告意外發現的意見尚不統一。如ACMG推薦有明確臨床意義的意外發現需要報告[63]；CAP要求實驗室應根據當地法律法規，制定是否報告意外發現的程序文件[41]；歐洲人類遺傳學會（ESHG）認為患者有權選擇是否報告意外發現，並建議檢測項目應局限在與臨床症狀相關的基因，以減少意外發現[63]；EuroGentest建議生物信息學分析時只分析待測目的基因，以避免意外發現[13]。考慮到國內從事遺傳諮詢的專業人員較為缺乏，以及遺傳諮詢培訓尚未成熟，為避免給患者帶來不必要的擔憂和焦慮，建議與腫瘤無關的意外發現不在報告中進行呈現。

在對如結直腸癌、卵巢癌、胰腺癌和乳腺癌等具有遺傳傾向的腫瘤進行NGS檢測時，需結合家族史，考慮是否為遺傳性腫瘤，並建立遺傳諮詢流程，具體內容可參考《高通量測序技術臨床規範化應用北京專家共識（第一版遺傳病部分）》[64]。

【共識8】實驗室應對體細胞基因突變藥物療效預測的臨床意義進行解釋。實驗室應制定結果解釋的SOPs，並遵循準確、及時和充分的原則。在需要的情況下，臨床實驗室應給出進一步檢測的建議。由於樣本質量或其他質量要求未達到，但樣本有限的情況進行的讓步檢測，也應在報告中進行說明。與腫瘤無關的意外發現因難以解釋，建議不在檢測報告中進行呈現。在對如結直腸癌、卵巢癌、胰腺癌和乳腺癌等具有遺傳傾向的腫瘤進行NGS檢測時，需結合家族史，考慮是否為遺傳性腫瘤，並建立遺傳諮詢流程。

四、總結

NGS技術在腫瘤的精準診療中具有重要作用，實驗室應加強質量管理，保證NGS檢測結果的準確性。本共識對實體腫瘤體細胞基因突變NGS檢測中的臨床預期用途確定、方法建立與優化、LDTs性能確認、分析前中後的質量保證關鍵環節進行了闡述。目前，實體腫瘤基因突變NGS突變檢測主要用於腫瘤靶向用藥指導及其耐藥監測和免疫治療療效評估。隨著發展，新的生物標誌物將不斷出現，新的NGS測序技術不斷進入臨床檢測，預期用途還會進一步擴大。本共識將適時修訂，以適應腫瘤基因突變高通量測序技術臨床規範化應用的需求。

對於實體腫瘤胚系變異NGS檢測的相關內容，可具體參考《高通量測序技術臨床規範化應用北京專家共識（第一版遺傳病部分）》[64]，本共識不再贅述。

本項目主持者：李金明（國家衛生健康委臨床檢驗中心）；王清濤（北京市臨床檢驗中心，首都醫科大學附屬北京朝陽醫院檢驗科）；賈玫（北京大學人民醫院檢驗科）。

其他略

文章來源：基因谷