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溶液配製：
0.8 M Mannitol儲液：稱取145.74 g Mannitol，加ddH2O溶解後定容至1 L。
0.1 M MES（pH5.7）儲液：稱取1.95 g MES，加ddH2O溶解後定容至100 mL。
1.5 M MgCl2儲液：稱取30.50 g MgCl2•6H2O，加ddH2O溶解後定容至100 mL。
1 M KCl儲液：稱取7.45 g KCl，加ddH2O溶解後定容至100 mL。
1 M CaCl2儲液：稱取14.70 g CaCl2•2H2O，加ddH2O溶解後定容至100 mL。
W5溶液：154 mM NaCl，125 mM CaCl2，5 mM KCl，2 mM MES（pH5.7）。
1 L W5：9 g NaCl，18.37 g CaCl2•2H2O，0.37 g KCl，20 mL 0.1 M MES（pH5.7），ddH2O定容至1 L。
蛋白提取液：0.05 M HEPES-KOH（pH 7.5），0.15 M KCl，1 mM EDTA，0.2% Triton-X 100，1 mM DTT，Protease Inhibitor Cocktail。
酶解液:
10 mL
20 mL
50 mL
Cellulase R10
0.125 g
0.25 g
0.625 g
Macerozyme R10
0.03 g
0.06 g
0.15 g
0.8 M Mannitol
5 mL
10 mL
25 mL
1 M KCl
200 μL
400 μL
1 mL
0.1 M MES
2 mL
4 mL
10 mL
55℃水浴10 min，冷卻至室溫，再加入下面組分
1M CaCl2
100 μL
200 μL
500 μL
BSA
10 mg
20mg
50 mg
ddH2O
2.7 mL
5.4 mL
3.5 mL
β-巰基乙醇
3.5 μL
7 μL
17.5 μL
10 mL
20 mL
50 mL
0.8M Mannitol
5 mL
10 mL
25 mL
1.5 M MgCl2
100 μL
200 μL
500 μL
0.1 M MES
400 μL
800 μL
2 mL
ddH2O
4.5 mL
9 mL
22.5 mL
10 mL
20 mL
50 mL
PEG4000
4 g
8 g
20 g
0.8M Mannitol
2.5 mL
5 mL
12.5 mL
1 M CaCl2
400 μL
800 μL
2 mL
ddH2O
3 mL
6 mL
15 mL
*以上所有溶液均為ddH2O配製。儲液配製後高壓滅菌，室溫存放。使用時在超淨臺內打開。
*酶解液、PEG、MMg、W5不需滅菌，可4℃存放一周左右。
實驗流程：
1. 質粒提取按QIAGEN質粒大量提取試劑盒（QIAGEN，#12362）說明進行。
2. 反應體系：
1）小反應體系，用於檢測蛋白質定位或表達，每個反應需5片葉子，5 mL酶解液，10 μg質粒。
2）大反應體系：檢測兩個蛋白的相互作用時，每個反應需要30片葉子，10 mL酶解液各100 μg質粒（或根據質粒表達量適當調整），為大反應體系。
3）若進行質譜分析，每個樣品需20個大反應。
3. 選擇短日照4周左右，生長狀態良好的擬南芥野生型Col-0植株進行取材。取青綠色較為平整的葉片，於0.4 M甘露醇中切成細絲，用鑷子挑進裝有酶解液的三角瓶中。酶解液體積及葉片的數量根據反應數而定。
4. 酶解：22℃，45 rpm直到酶解完全，約4 h左右。
5. 120目尼龍網或Miracloth濾布過濾酶解液，濾液裝入50 mL離心管中。
6. 室溫，100 g，離心3 min，收集原生質體細胞。離心機升降速率均設為2，此後離心均按此參數設定。
7. 棄上清，加入20 mL W5溶液，輕輕懸浮細胞。
8. 室溫，100 g，離心3 min，收集原生質體細胞。用20 mL W5溶液清洗細胞一次。
9. 最後用20 mL W5溶液懸浮細胞，冰上放置30 min。
10. 室溫，100 g，離心3 min，收集原生質體細胞。加入適量預冷的MMg溶液，輕輕懸浮細胞後置於冰上備用。
11. 轉化：
1）小反應體系：
a．轉化過程在2 mL離心管中進行。先將質粒加入管底，隨後用剪掉尖端的槍頭吸取200 μL原生質體懸液，加入到離心管中。輕輕將原生質體和質粒混勻。再加入等體積（質粒和原生質體體積之和）的PEG溶液，輕輕混勻後室溫放置7 min進行轉化。
b．加入4倍體積的W5溶液終止反應。室溫，100 g，離心3 min。
c．棄上清，3倍體積W5溶液洗原生質體2次，以去除殘留的PEG。
d．最後加入1 mL W5溶液平放於弱光下，22℃過夜培養。
2）大反應體系：
轉化過程在50 mL離心管中進行。質粒各100 μg加至離心管底。再加入3 mL原生質體，輕輕將原生質體和質粒混勻。然後加入等體積（質粒和原生質體體積之和）的PEG溶液，輕輕混勻後室溫放置7 min進行轉化。其餘清洗步驟與小反應體系相同。最後加入20 mL W5溶液重懸細胞，22℃過夜培養。
12. 原生質體的收集：室溫，300 g，離心2 min收集過夜培養的原生質體。
1）若是直接用於顯微鏡觀察可棄去大部分上清，保留小部分用於重懸細胞，取樣觀察。
2）若是用於蛋白質提取則棄去上清，加少量W5溶液將細胞轉移至1.5 mL離心管。隨後加入適量蛋白提取液裂解細胞。對於大反應，每管中加入600 μL蛋白提取液。
13. 如提取蛋白，則裂解細胞，渦旋振蕩1 min，冰上1 min，重複一次。最後於冰上靜置5 min。
14. 4℃，14000 rpm，離心10 min。取上清用於後續蛋白實驗。
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