第八章 工業微生物雜交育種
第一節 雜交育種原理
一、基因重組：將兩個不同形狀個體內的基因轉移到一起，經過重新組合，形成新的遺傳型個體的過程稱為基因重組。
二、雜交育種微生物傳遞的途徑
1、通過雙親細胞的融合，涉及到整套染色體的基因重組，如真核微生物的有性生殖、準性生殖。（酵母菌雜交、黴菌的雜交）
2、通過雙親細胞的溝通，涉及到部分染色體的基因重組，如原核微生物的接合，（F因子傳導）
3、雙親細胞不接觸，僅個別少數基因的重組，如原核微生物的轉導、轉化。（噬菌體感染）
三、雜交育種
一個菌種長時間使用誘變劑處理後，其生活能力逐漸下降，如生長周期延長、孢子減少、代謝減慢、產量增加緩慢等。故雜交育種就成為菌種選育的另一重要手段，雜交是細胞水平的概念，而基因重組是分子水平的概念。
已知供體、受體親本。雜交育種更具在方向性，但方法複雜、進度慢，篩選工作大，應用不廣。
四、雜交育種的目的
1、改變親株的遺傳物質基礎，擴大變異範圍，使兩親株的優良性狀集中於重組體內，獲得新品種；
2、克服因長期誘變造成的生活力下降、代謝緩慢等缺陷，也可以提高對誘變劑的敏感性，降低對誘變劑的「疲勞」效應。
3、使不同菌株的遺傳物質進行交換和重新組合，從而改變原有菌株的遺傳物質基礎，獲得雜交株。
4、分析雜交結果，可以總結遺傳物質的住那一和傳遞規律，豐富並促進遺傳學理論的發展。
五、微生物雜交育種基本程序
選擇原始親本→ 誘變篩選直接親本→直接親本之間親和力鑑定→雜交→分離到基本培養基或選擇性培養基培養→篩選重組體→重組體分析鑑定。
六、雜交育種使用的材料
1、出發菌株 2、培養基 3、器皿 4、直接親本（標記菌）
第二節 原核微生物的雜交育種
一、細菌雜交育種（重點）
（一）接合是指兩個性別不同的微生物細胞之間接觸，遺傳物質轉移、交換、重組，形成一個新個體。（指通過供體菌和受體菌的完整細胞的直接接觸，傳遞大片的DNA（包括質粒）遺傳信息的的現象。
（二）致育因子
細菌的雜交關鍵是性因子，即F因子。F因子是一種質粒，它存在於細菌的細胞質中，一般為游離狀態，有時和染色體以結合態存在，是一種穩定的遺傳物質。
1、F+菌株：具備F性因子的細胞稱為有性因子菌株（F+），即「雄性」菌株，為供體菌。其F因子獨立存在，細胞表面有性菌毛。又稱為低頻重組菌種。
2、F-菌株：不具備F性因子的細胞稱為無性因子菌株（F-），即「雌性」菌株，為受體菌。無有性菌毛，可通過接合作用接收F因子變成F+.
3、Hfr菌株：有時供體菌的F因子可以整合到細胞染色體DNA上，這樣使F+菌株成為高度致育細胞，稱為Hfr菌株，這類菌株的特點是不僅細胞內很有F因子，而且F因子的DNA嵌入染色體的DNA中。轉移染色體基因的能力很高，重組頻率大，又稱高頻重組菌株。其細菌表面有性菌毛。
4、F『菌株：Hfr菌株內的F因子因不正常切割而脫離染色體，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子稱為F』因子。含有這種性因子的菌株就稱為F『菌株，又稱低頻重組菌株。
F因子轉導：當F『細胞與F-細胞接合時，把所攜帶的供體菌部分染色體基因也同時轉移到F-細胞中去，使受體菌株遺傳性狀發生改變而獲得重組體，這個過程稱為F因子轉導。
（三）雜交過程 詳見書P259
1、F-*F+雜交——重組頻率低
（1）F+細菌通過性毛與F-細菌接觸並發生相互作用；
（2）F+細菌的F因子出現缺口，雙鏈之一被切斷，從斷端轉移F因子的一條鏈到F-細菌中；
（3）F因子的一條鏈進入F-細菌中，在F-細菌中複製新的F因子；
（4）複製完成後，F-細菌變成了F+細菌，同時原有F+細菌也完成了F因子的複製。
2、Hfr*F-雜交——雜交最好組合
雜交過程：當Hfr菌株與F-菌株接觸，細胞壁溝通，Hfr細胞染色體單鏈打開，遠離F因子一端的染色體DNA先進入F-細胞內，F因子到最後才轉入或不轉入到F-菌株中，待進入F-菌株細胞的一段供體染色體和受體染色體結合形成部分合子，經過雙交換或兩次單交換，Hfr菌株的一段染色體整合到F-菌株細胞的環狀染色體中，形成具有一定新遺傳性狀的重組體菌株。
中斷雜交實驗——如果在兩個配對菌株拉倒過程中，每隔一定時間以強烈攪拌中斷接合，結果導致Hfr菌株轉移到F-菌株中染色體節段的斷裂位置不一，由此造成進入受體細胞具在Hfr性狀的基因數量和種類不同，從而可獲得多樣化類型的重組體，稱為中斷雜交實驗。
（四）細菌雜交方法與技術P262
1、雜交親本菌株，根據實驗選擇不同遺傳特性的兩親本菌株，並且要還一定選擇性標記和非選擇性標記。
2、標記菌株，最常用的標記為營養缺陷。
3、性別菌株的獲得：F+菌株，F+菌株與F-菌株接合併把F因子轉移到F-菌株中，從而使F-菌株轉變為F+菌株；F-菌株，把F+菌株用不足以抑制其生長的低濃度吖啶橙處理即可得F-菌株；Hfr菌株，通過F+菌株和F-菌株雜交獲得。
4、雜交方法，細菌雜交一般採用直接混合法（詳見P262）：將兩個直接親本菌株分別培養至對數期，再將Hrf菌株和F-菌株細胞以1：10或1：20的比例混合，水浴振蕩，菌株細胞接合，親本菌株間的染色體進行連接、交換和重組，然後稀釋塗布在基本培養基上或其他選擇性培養基上篩選得到各種重級菌株或其他雜交後代。
二、放線菌的雜交育種（重點）
（一）放線菌雜交原理：通過供體向受體轉移部分染色體，經過遺傳物質交換，最終達到基因重組。雜交原理相似於細菌，雜交方法相似於黴菌。放線菌的雜交只發生在具有一定感受態菌株之間。P265
1、異核現象：有些放線菌的營養缺陷型在混合培養或雜交過程中，經菌絲和菌絲間的接觸和融合而形成異核體。
2、接合現行：菌絲間接觸和融合後，相同細胞質裡把不同基因型的細胞核在雙方增殖過程中，發生部分染色體的轉移或遺傳信息的交換，接合現象導致部分合子的形成。
3、雜合系的形成：部分合子形成後，在繁殖複製過程中，兩種不同基因型的染色體進行一次交換，產生雜合系。雜合系是由基質菌絲中長出來的，形成的菌落很小，能在選擇性培養基和基本培養基上生長。
4、重組體的形成：以上檢出的雜合系或重組雜合系，在以後進一步繁殖過程中，雜合狀態染色體的不同區段還要進行幾次交換。根據交換的位置不同，所攜帶的基因種類、數量也不一致，形成了一系列基因型的環狀染色體細胞，從產生的菌落中可檢出不同類型重組分離子。雜合系是形成重組體所必須的階段。
（二）放線菌雜交過程（示意圖見P266）
親本→局部結合子（部分合子）→雜合系→重組體
1、部分結合子是由一個供體細胞的部分染色體和一個受體細胞整套染色體相結合，同時存在於一個細胞質中，也有時兩個親本細胞的染色體都是以部分染色體進行結合。兩個親本細胞以全部染色體進行結合形成的異核體在複製過程中染色體不發生交換，所產生的分生孢子進一步培養又獲得兩親本。
2、部分合子形成後，在繁殖複製過程中，兩種不同基因型的染色體進行一次交換，產生了雜合系。雜合系是由基質菌絲中長出的，形成的菌落很小，能在選擇性培養基和基本培養基上生長。
3、雜合系不是封閉的環狀結構而是呈線狀，經過進一步繁殖，形成一系列基因型的環狀染色體細胞，從而形成重組體。
（三）放線菌的雜交技術 圖示P267
放線菌雜交方法有混合培養法、雜核系分析法、玻璃紙法和平板雜交法等。
一、混合培養法：
（1） 直接親本是雜交配對菌株，要求攜帶不同的營養缺陷型或抗性作為遺傳標記。
（2） 斜面混合接種（CM），即取兩親標新培養的成熟孢子或菌絲，重迭接種到完全培養基斜面。
（3） 單孢子的製備，即制單孢子懸液。
（4） 重組體的檢出：用選擇性平板分離得到目的重組體。
二、雜合系分析法：圖示P270
從混合培養的孢子懸液中，分離篩選雜合系，再進一步從雜合第中篩選各種分離子。
兩親本混合培養→孢子懸液→MM培養基培養→取雜合系菌落（較小的）上的孢子製成單孢子懸液→CM培養基上培養→點種→影印到多種不同的選擇性培養基平板上→得到所需要的重組體
三、玻璃紙法：
兩親本都具有營養缺陷型標記，且對同一藥物一個敏感，另一個具有抗性。
兩親本孢子混合，接種到覆蓋於CM培養基的玻璃紙表面，經一定時間培養，將玻璃紙轉移到含有藥物的SM培養基上培養，得到惟獨能生長的特定雜合系菌叢。
四、平板雜交法：將CM上培養的A親本菌落孢子影印至在CM（或有限培養基）上培養的B親本菌落平板上，培養一段時間，兩親本菌絲接合形成部分合子，染色體進行單交換後形成雜合系，然後影印其孢子到各種選擇性培養基平板上，從中可檢出重組體分離子。
註：有限培養基（LM）是由CM和MM以1：9組成。
三、轉導（了解）
定義：藉助溫和噬菌體為媒介，把供體細胞中DNA片段攜帶到受體細胞中，從而使後者獲得前者部分遺傳性狀的現象，稱為轉導。 獲得新遺傳性狀的受體細胞稱為轉導子。 轉導過程不需要接觸，而是以噬菌體為載體。
（一） 普通（普遍）傳導：媒介為完全缺陷噬菌體（侵染後其DNA為供體細胞的）
（二） 局限傳導：媒介為部分缺陷噬菌體（侵染後其部分DNA為供體細胞的）
四、轉化（了解）
轉化是受體菌直接吸收環境中供體菌的DNA片段而獲得後者部分遺傳性狀的現象。
轉化因子：起轉化作用的供體細胞的DNA片段；轉化子：通過轉化作用形成的受體細胞。
特點：1. 一般只發生在同一物種或近緣物種之間；2.受體細胞只有處於感受態階段才能吸收供體的DNA.
感受態：指細胞能從周圍環境吸收DNA分子，將其整合入自己的基因組，並保證不被體內DNA酶破壞的生理狀態，即實現轉化的一種生理狀態。
轉化育種條件：1、感受態的出現（a受體細胞的遺傳，b生理狀態，c菌齡，d培養條件）；2、供體DNA濃度（實現轉化所需的DNA濃度極低）；3、DNA相對分子質量（一般為10*-7，約含有50個基因，太短則不能轉化）；4、感受態因子（它是一種胞外蛋白）。
第三節 真核微生物的雜交育種
一、有性雜交：不同遺傳型微生物的性細胞（單細胞）發生接合和重組的現象。
準性雜交：不同遺傳型微生物體細胞的核融合而導致的一種低頻率基因重組現象（親緣關係很近的親本）。
二、黴菌的雜交育種P277
（一）黴菌的準性生殖
兩親本→準性接合→基因重組→新遺傳型→菌絲聯結→質配→核配→有絲分裂→單倍子
準性生殖和有性生殖的區別； 準性生殖 有性生殖
參與接合的親本細胞 形態相同的體細胞 形態、生理上存在分化的性細胞
獨立生活的異核階段 有 無
接合後雙倍體細胞形態 與單倍體相同 與單倍體不同
雙倍體變成單倍體的途徑 有絲分裂 減數分裂
頻率 偶然 、低 正常出現、高
（二）準性生殖的三個階段：
在菌絲體生長過程中，不同遺傳類型的菌絲細胞接觸融合，形成異核體、雜交二倍體，最後經染色體相互交換，產生一個具有新遺傳特性的菌株。
異核體的形成（不穩定）→雜合雙倍體的形成（穩定）→體細胞交換和單元化（單倍體化）
異核體：具有不同性狀的兩菌株的菌絲互相連接，導致在一個細胞或一條菌絲中並存有兩種或兩種以上不同遺傳型的細胞核，進行質配，兩個不同基因型的核獨立存在，這樣的菌絲體稱為異核體。（可參照P279的定義）。異核體屬於不穩定菌株，它們所產生的分生孢子會分離成兩種親本型，不能在MM上生長。
雜合雙倍體的形成：異核細胞不夠穩定，異核體中不同基因型的兩個核有少數可發生細胞融合，進行核配，形成二倍體核，其存在較穩定。採用天然樟腦蒸氣燻蒸或紫外線照射異核體，可以誘發異核體形成雜合二倍體。 體細胞交換：是指雜合二倍體核在有絲分裂過程中的交換現象，染色體之間發生交換而產生部分標記。（頻率0.001） 單倍化：指雜合二倍體細胞在增殖過程中，基因藉助整條染色體的隨機交換而得到單倍重組體或單倍的親本分離子。（頻率0.01）
（三）黴菌雜交技術
（1）選擇親本；（2）強制異合；（3）移單菌落；（4）穩定性檢驗（雜合二倍體穩定，而異核體不穩定）；（5）促進變異（紫外線處理……）。
說明：雜合二倍體常常在異核體菌落上以角變或斑點形態出現，用接種針挑取其分生孢子，則可分離、純化得到雜合二倍體。（移單菌落）
三、酵母菌的有性雜交
（一）有性雜交：指性細胞間的接合和隨之發生的染色體重組，並產生新遺傳型的一種育種技術。
雌雄菌株→有性接合→染色體重組→新遺傳型
（二）酵母有性雜交育種的基本過程
1、親株的選擇：具有親合性和遺傳標記，考慮育種的目的性；
2、形成子囊孢子（用產孢培養基）
3、接合：酶法或機械法破碎子囊，釋放孢子，再平板塗布培養得到單倍體細胞，然後將兩個親本的單倍體細胞密集在一起，就可能的發生接合獲得各種類型雜合子
4、雜交二倍體的篩選，從不同的雜合子中篩選初優良性狀的個體。
酵母的雙倍體與單倍體差異大
雙倍體 單倍體
細胞 大，橢圓形 小，球形
菌落 大，形態均一 小，形態變化較多
液體培養 繁殖較快、細胞較分散 繁殖較慢，細胞常聚集成團
在產孢培養基上 能形成子囊 不能形成子囊
問：為什麼有性雜交親本可以不做標記，而準性雜交親本需要做標記？
1、有性雜交頻率比準性雜交頻率高。
2、有性雜交親本一、親本二與重組體的細胞、菌落形態都不一樣。[原核微生物雜交親本也做標記]
相關連結：2013年自考《微生物遺傳學》考點