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Cell Press細胞出版社微信公眾號對該論文進行了解讀，旨在與廣大科研人員深入分享該研究成果以及一些未來的展望。點擊「閱讀原文」或識別下圖二維碼閱讀英文原文最新在中心上線的發表在Cell Press細胞出版社旗下期刊Cell上的研究，名為」 Amplification-free detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy」。來自Gladstone 研究所的科研人員發明了一種免擴增的CRISPR-Cas13a檢測技術，該技術可從鼻拭子RNA中直接檢測SARS-CoV-2，並且可以通過手機顯微鏡對其進行讀取。該檢測方法有可能實現針對SARS-CoV-2的低成本快速即時篩查。
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摘要
2019年12月暴發的新型呼吸道病毒SARS-CoV-2現已發展為全球大流行，部分原因是確定感染該病毒的有症狀患者、無症狀攜帶者和有前驅症狀的攜帶者十分困難。如果CRISPR診斷程序可以快速、便攜和準確地進行，那就可以增強基於PCR的金標準診斷測試。在此，我們報告了一種免擴增的CRISPR-Cas13a檢測技術，該技術可從鼻拭子RNA中直接檢測SARS-CoV-2，並且可以通過手機顯微鏡對其進行讀取。該測定法在30分鐘的測量時間內即可達到約100拷貝/μL的靈敏度，並且能在5分鐘內從一組陽性臨床樣品中準確地檢測出預提取的RNA。我們結合了靶向SARS-CoV-2 RNA的crRNA來提高這一檢測方法的敏感性和特異性，並利用酶動力學直接量化了病毒載量。結合手機讀取設備，該檢測方法有可能實現針對SARS-CoV-2的低成本快速即時篩查。
簡介
目前，SARS-CoV-2感染的金標準診斷方法是定量逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-qPCR），這也是一種廣泛應用於篩查的成熟檢測手段。基於針對核衣殼（N）蛋白、包膜（E）蛋白和開放閱讀框1ab（ORF1ab）基因的引物，RT-qPCR的分析檢測限度（LOD）為1,000病毒RNA拷貝/ mL，即1拷貝/μL（Vogels et al., 2020）。然而，最新的病毒動力學模型表明，為了控制當前的大流行，我們需要一種能夠快速周轉的高頻檢測手段（Larremore et al., 2020）。值得注意的是，該模型將檢測的敏感性列為較低優先級，估計100,000拷貝/ mL（100拷貝/μL）的LOD就足以達到篩查水平（Larremore et al., 2020）。儘管研究人員對於所需的準確目標LOD尚未達成廣泛共識，但高頻檢測和快速周轉有助於減少病毒傳播，即使檢測的敏感性不高。在臨床研究中，當病毒載量在1,000,000百萬拷貝/ mL（1,000拷貝/μL）以下時，傳染性顆粒幾乎不能檢測到，因此病毒傳播的風險很低（La Scola et al., 2020; Quicke et al., 2020; Wolfel et al., 2020）。
人們亟需一種能夠識別傳染性個體且快速而廣泛的SARS-CoV-2檢測，這一需求促使人們致力於探索基於CRISPR技術的病毒RNA檢測新策略。Cas12和Cas13蛋白是細菌適應性免疫系統的RNA引導成分，它們分別直接靶向單鏈、雙鏈DNA或單鏈（ss）RNA底物（Abudayyeh et al., 2016; Chen et al., 2018; East-Seletsky et al., 2016; Zetsche et al., 2015）。Cas13與含有可編碼間隔序列的CRISPR RNA（crRNA）結合，形成了一種不激活核酸酶的核糖核蛋白複合物（RNP）。當RNP與互補的目標RNA結合時，它能激活Cas13的HEPN基序（高級真核生物和原核生物的核苷酸結合區域），然後不加選擇地切割周圍的任何ssRNA。RNP與目標RNA的結合和隨後的Cas13裂解活性可通過與ssRNA連接的螢光猝滅劑進行檢測，ssRNA在激活Cas13裂解後會發出螢光（East-Seletsky et al., 2016）。
使用細菌誘導細胞休眠以減少噬菌體傳播的成功策略（Meeske et al., 2019）現已廣泛用於病毒診斷（Chen et al., 2018; East-Seletsky et al., 2016; Gootenberg et al., 2018; Gootenberg et al., 2017; Myhrvold et al., 2018）。為了實現檢測的高靈敏度，目前的CRISPR診斷法（CRISPR Dx）依賴於目標RNA的預擴增，以便用於隨後的Cas蛋白檢測。對於RNA敏感的Cas13蛋白，人們需要通過一系列複雜的方法才能對Cas13a或Cas13b進行檢測，這種方法被稱為「SHERLOCK」法（Gootenberg et al., 2018; Gootenberg et al., 2017）。該方法最近被用於SARS-CoV-2的檢測（Joung et al., 2020b），並進一步發展為用於檢測未提取樣品的「SHINE」法（Arizti-Sanz et al., 2020）。通過使用DNA敏感的Cas12進行檢測，可以避免將擴增的DNA轉換回RNA，這種方法稱為「DETECTR」法（Chen et al., 2018），最近已用於SARS-CoV-2的檢測（Broughton et al., 2020）。SHERLOCK和DETECTR法可以使用適用於即時檢測的紙質側向流動條進行讀取，但都需要大約一個小時才能完成，而且目前FDA批准的檢測方法仍然是基於實驗室的。
在此，我們報導了一種基於CRISPR-Cas13a的快速檢測方法並進行了演示，這種方法可直接檢測SARS-CoV-2 RNA。與既往的CRISPR診斷不同，這種方法不需要預先擴增病毒基因組即可進行檢測。無需進行其他操作，該方法就可以進行定量RNA測量，而不是僅僅得出簡單的陽性或陰性結果。為了證明該測定法的簡便性和便攜性，我們使用小型精簡設備的手機攝像頭進行了螢光測試，這種設備使用了低成本的雷射照明和光學採集器件。因為手機攝像頭具有高靈敏度和強連接性，以及GPS和數據處理功能，所以這是一種可以應用到資源匱乏地區的有益工具，有助於即時地診斷疾病（Breslauer et al., 2009; D'Ambrosio et al., 2015; Kamgno et al., 2017; Wood et al., 2019）。通過組合多個crRNA來增強Cas13a的活化並分析螢光隨時間的變化（而不是只分析終點螢光），我們能夠使用該設備在30分鐘的測量時間內檢測到約100拷貝/μL的預提取SARS-CoV-2 RNA。我們還可以使用該設備在5分鐘內正確識別出所有用於測試的SARS-CoV-2陽性患者的RNA樣品（Ct值14.37~22.13）。這種方法或可為即時SARS-CoV-2篩查提供快速、準確、便攜的低成本選項。
結果
用Cas13a直接檢測並量化新冠病毒RNA
當SARS-CoV-2序列於2020年1月公開時，我們著手開發了一種基於Cas13的病毒RNA直接檢測方法，該測定法無需擴增病毒RNA即可進行即時檢測。為此，我們需要通過仔細選擇合適的crRNA來優化Cas13的激活，並為我們的測定方法開發靈敏度高且便攜的螢光檢測系統（圖1A）。最初，我們根據SARS-CoV-2的N蛋白基因設計了12個crRNA（表S1）。每個Cas13-crRNA RNP都能檢測到N蛋白基因中單個長20個核苷酸的區域（圖1B）。
在480 fM（2.89 x 105拷貝/微升）的目標RNA濃度下，我們鑑定出了10個具有活性的crRNA。我們在平板讀取器上通過直接檢測測定法分別測試了每個crRNA，最終選擇了兩個crRNA（crRNA 2和4）進行後續試驗，因為它們對Cas13a活化的作用最大。
接下來，我們對目標RNA進行了稀釋，以分別確定每種crRNA的檢測限度。LbuCas13a在低至10 fM（約6000拷貝/μL）的目標RNA水平上顯示出了可探測到的報告基因裂解，（East-Seletsky et al., 2017）。針對SHERLOCK法的研究曾報導，未進行預擴增的檢測限度為約50 fM（Gootenberg et al., 2017）。與此相符的是，我們發現，對於1,000拷貝/μL的體外轉錄（IVT）目標RNA濃度，使用crRNA 2和crRNA 4製成的RNP似乎不會產生高於RNP對照的螢光信號（圖1D）。通過Cas13a直接檢測產生的信號似乎與測定中目標RNA的濃度成正比。結果證實，crRNA 2和4均促進了至少10,000拷貝/μL的IVT N基因RNA探測（圖1E）。另外，我們證實了Cas13a激活的速率與目標RNA的濃度成比例（圖S1B-D）。
組合crRNA可提高Cas13a的敏感性
接下來，我們在同一反應中組合了crRNA，從而形成兩個不同的RNP亞群，然後我們評估這種方式能否增強Cas13a的整體活化，從而提高測定的靈敏度。研究發現，crRNA 2和4的結合顯著增加了檢測反應的斜率和反應的敏感性（圖2B）。為了確定crRNA組合如何影響檢測限度，我們使用了經過稀釋的一系列IVT N蛋白基因RNA對crRNA 2 + 4進行了測試。與無靶標的RNP對照（RNP 2 + 4）相比，crRNA 2 + 4與RNP的組合將檢測限提高到至少100拷貝/μL IVT目標RNA（圖2C）。我們從SARS-CoV-2感染的Vero CCL-81細胞上清液中分離了病毒RNA並對其進行了相同的測定，發現該測定法可以檢測到至少270病毒拷貝/μL的RNA（圖2D）。
CRISPR診斷的一個主要優點是它們的高度特異性。為了確認我們的crRNA的特異性，我們使用了一組不同於新冠病毒的呼吸道病毒進行了測試，包括α冠狀病毒HCoV-NL63、β冠狀病毒HCoV-OC43，以及中東呼吸症候群冠狀病毒（MERS-CoV）。我們將crRNA 2和4單獨或組合使用於Cas13a直接檢測分析時，對於任何測試的病毒RNA，我們都未檢測到高於背景RNP的信號（圖3A）。
討論
在此，我們展示了使用CRISPR-Cas13a和手機直接檢測SARS-CoV-2 RNA的方法，為快速即時檢測提供了一種頗有前景的選項。本研究取得的第一個關鍵進展是證明了crRNA組合可以通過激活更多的Cas13a（以每個目標RNA計）來提高檢測的敏感性。我們的研究表明，兩個或三個crRNA的組合可用於探測低至約30拷貝/μL的目標病毒RNA。充分利用靶向基因組不同部分的各種crRNA也可以避免由於自然發生的病毒突變而導致的不完全檢測。
本研究取得的第二個關鍵進展是將螢光信號直接轉化為病毒載量的量化。我們設計的方法無需對病毒RNA進行擴增，而是採用直接探測的方法。在這一過程中，我們顯示了反應速率與病毒拷貝數直接相關，因而可用於定量分析。結合高頻檢測，定量數據可能會帶來許多益處：可以監測患者感染的病程，確定感染是在增強還是減弱。既往研究提出，有症狀感染者中，病毒載量隨感染病程的變化而變化（Wolfel et al., 2020）。定量監測病毒載量可以估計患者的感染階段，且有助於實時預測患者的感染力、恢復力和解除隔離的恰當時機。
本項工作的第三個關鍵進展是開發了基於行動電話和低成本光學器件的小型顯微鏡，可用於準確讀取Cas13a直接檢測的分析結果，在30分鐘內可實現約100拷貝/μL的靈敏度；而且，該設備可以在5分鐘內準確診斷從患者樣品中預先提取的一組RNA。這表明可以構建基於消費電子產品而非專業實驗室技術的可攜式診斷設備，並與Cas13a分析一起使用。結合對密切接觸者的有效跟蹤以及上傳至雲系統的數據，移動可攜式SARS-CoV-2診斷程序可以在當前和未來的大流行中發揮重要作用。
雖然我們證明了使用基於現有PCR引物的crRNA可以實現靈敏度較高的快速檢測，但我們也希望能系統地搜索整個病毒RNA基因組中最佳的crRNA組合，從而進一步改善該檢測手段。隨著研究者發現了更多有關病毒變體的信息（Osorio and Correia-Neves, 2020; Vanaerschot et al., 2020），人們可以調整crRNA設計，從而避免假陰性結果。不過，組合crRNA在提高靈敏度的同時也導致意外脫靶的機率升高了。而且，當組合中的一種crRNA與樣品中的病毒序列不完全匹配時，只有較低的病毒載量得到了記錄。未來的研究有望進一步改進報告基因、Cas13蛋白的選擇，以及探測裝置和攝像頭的感光度。這些進展或許能提高反應速率，從而可以在較短的時間內提高檢測的精度和檢測限度。
最近一項針對超過19,000多名受訪者的全國調查顯示，基於鼻拭子的qPCR測試結果的平均等待時間為4.1天，其中31％的檢測耗費4天以上，而10％的測試耗費10天或更長時間（Lazer et al., 2020）。處理這些實驗室檢測的國家積壓工作清楚地突出了我們對快速即時檢測的需求。由於自然感染或疫苗接種產生的長期免疫力可能會在2-4個月內下降（Ibarrondo et al., 2020; Long et al., 2020），因此對新冠病毒的快速高頻檢測需求可能會持續存在。在未來，我們在此提出的Cas13a直接檢測方法可以迅速進行調整，服務於下一種可能暴發的呼吸道病原體檢測，希望能夠及時遏制傳染性疾病在全球範圍內的擴散。
相關論文信息
原文刊載於CellPress細胞出版社旗下期刊Cell上
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▌論文標題：
Amplification-free detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy
▌論文網址：
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(20)31623-8#figures
▌DOI：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.12.001
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