近年來，關於蛋白質聚集體形成條件和形成機制受到人們的關注。由於尺寸效應及表面結構的差異，蛋白聚集體的界面活性、黏彈性、乳化特性等可能優於天然蛋白質。另一方面，蛋白聚集體作為乳化劑在油-水界面形成的蛋白膜結構和流變學特性會影響脂肪消化特性。蛋白膜的交聯程度和黏彈性會影響小分子乳化劑如膽鹽對界面蛋白的取代，即當油-水界面形成了強烈交聯蛋白質膜時，小分子可能很難對其發生取代，從而影響脂肪的消化。但是目前對蛋白聚集體對脂肪消化的影響研究鮮有報導。
對於蛋白膜結構和流變學特性的研究方法主要包括原子力顯微鏡、界面剪切流變學、界面膨脹流變學等。但由於界面蛋白吸附是一個動態的過程，形成的蛋白膜結構較弱且不均一，上述傳統研究方法或很難實現原位測量，或難以給出局部信息。而微流變學作為一種新興的技術，可實現原位測量，並具有高敏感度。但到目前為止，利用界面微流變學系統研究不同蛋白聚集體界面行為的工作較少，並且聚集體對消化影響的研究更鮮見。
湖北工業大學生物工程與食品科學學院、菲利普斯膠體研究中心的葉晶、李靜和楊楠*等人主要利用示蹤粒子微流變學，結合膨脹流變學方法，研究不同質量分數的β-lg及其聚集體在中性pH值條件下的油-水界面吸附和被膽鹽小分子替代的行為，旨在通過對比納米顆粒聚集體（β-lg NP）和纖維狀聚集體（β-lg F）的界面吸附和替代過程，揭示蛋白聚集體的界面活性和抵抗膽鹽取代能力，進而闡明蛋白質聚集體對乳化和乳液脂肪消化可能產生的影響。
1 蛋白聚集體形貌
通過前期實驗對不同pH值下的熱處理蛋白質進行觀察，發現pH 5.8條件下得到的納米顆粒大小最為均一，且粒度較小，因此後期實驗均使用在pH 5.8下製得納米顆粒聚集體。圖1A1、B1分別為β-lg及β-lg NP凍幹後樣品復溶的TEM結果。結合水合粒徑分布圖（圖1A2、B2），可知β-lg為球狀，粒徑為（4.3±1.0）nm；而β-lg NP粒徑在（160±10）nm左右，且單分散性良好。在低pH值下，對蛋白分子進行熱處理，一般認為蛋白分子先水解為多肽，多肽再形成不同的次級結構（β-摺疊），這些次級結構通過分子間相互作用組裝形成纖維狀聚集體。所以可以通過控制pH值和溫度來製備纖維狀聚集體。圖1C1、D1為β-lg F凍幹前後TEM圖，利用Fiber App軟體對β-lg F凍幹前後的纖維長度統計結果如圖1C2、D2所示，凍幹前，纖維長度分布為1 400～2 500 nm；而凍幹後長度分布在100～700 nm之間，與凍幹前相比，纖維長度明顯減小。通過前期實驗對表面疏水性和表面電性測定，發現凍幹前後表面性質無明顯差異，因此為精確控制蛋白溶液濃度，本實驗中所用聚集體均為凍幹後樣品。
2 蛋白聚集體的界面吸附
2.1 示蹤粒子微流變學分析結果
圖2為110 μg/mL的β-lg、β-lg NP、β-lg F在油-水界面吸附過程中示蹤粒子的MSD曲線。可以看出，隨著吸附時間的延長，各樣品MSD減小。對於不同流動行為，MSD與時間可以表示為冪指數關係，即<Δr2（t）>＝4 Dτa，a為冪指數。在雙對數坐標中，MSD與時間關係曲線的斜率即為a。如果a等於1，即MSD隨時間線性變化，說明粒子在牛頓流體中運動，處於自由擴散；如果a＜1，表明粒子在具有黏彈性的物質中運動，處於亞擴散狀態。當a趨近於0時，粒子被束縛在黏彈性較強的物質中，此時粒子的運動被嚴重限制，隨時間的延長，MSD幾乎是一個常數。本實驗計算了不同質量濃度的β-lg、β-lg NP、β-lg F在不同吸附時間時油-水界面上示蹤粒子MSD對時間的冪指數a（圖3）。
由圖3可以看出，隨著時間的延長，對不同蛋白，a均減小，但不同形態蛋白降低快慢不同。如圖3A所示，25μg/mL下，對於β-lg界面，10 min時，a約為0.95左右，到50 min時，a約為0.75左右，示蹤粒子運動被一定程度的限制；但對β-lg F界面，10 min時，a約為0.85，與β-lg接近，但50 min時，a約為0，示蹤粒子運動被強烈限制；而對於β-lg NP界面，5 min時，a已經下降為0.56左右，30 min時a約為0。說明β-lg NP界面上示蹤粒子的運動在蛋白吸附的初期就被限制，界面很快形成。這些結果說明不同形態的蛋白聚集體向界面擴散的速度不同，聚集體吸附速度快於β-lg，且β-lg NP最快。110μg/mL和220μg/mL蛋白聚集體同樣顯示出類似規律（圖3B、C）。對於同一種蛋白，蛋白質量濃度越高，界面上示蹤粒子的a下降越快，運動被限制得越明顯，如β-lg在220μg/mL下，40 min時，a為0，說明粒子運動被完全限制。
2.2 界面膨脹流變學分析結果
圖4為不同質量濃度β-lg及聚集體β-lg NP和β-lg F向界面擴散過程中，界面壓（π）及界面膨脹模量（E）的變化。可以看出在所考察的3個質量濃度下，界面壓均隨時間延長快速增加，說明蛋白均向界面擴散。但不同質量濃度不同形態蛋白界面壓強和膨脹模量變化不同。
圖5A、B分別為不同質量濃度的3種形態蛋白的平衡後界面壓及膨脹模量數值。從圖5A可以看出，對於同種蛋白，隨著質量濃度的增加，平衡後的界面壓均增大；對於在相同質量濃度下的不同蛋白，β-lg F的界面壓最大，其次是β-lg NP。從圖5B可以看出，隨著蛋白質量濃度的增加，界面蛋白膜的膨脹模量即黏彈性也隨之增加；在相同質量濃度下，β-lg F的界面膜黏彈性最大，其次是β-lg NP，而β-lg的模量最小。
3 膽鹽對界面蛋白的取代
3.1 示蹤粒子微流變學結果
結果顯示，在每個質量濃度下，隨著膽鹽取代時間的延長，MSD及其斜率a均逐漸增加，說明示蹤粒子的運動限制逐漸緩解。對於同一種蛋白，隨著蛋白質量濃度的增加，MSD的斜率a變化減慢：如膽鹽取代25 μg/mL的β-lg達到55 min時，a接近1；而膽鹽取代110 μg/mLβ-lg達到60 min時，a約等於0.87；膽鹽取代220 μg/mLβ-lg達到65 min時，a僅約等於0.56。雖然膽鹽對25 μg/mLβ-lg NP進行取代後，MSD的斜率a隨著膽鹽取代時間延長而逐漸變大，但相比於β-lg的a小；而110 μg/mL及220 μg/mL下，a變化不明顯，在整個實驗觀察過程中均接近0，說明膽鹽取代過程慢，甚至被抑制。在25 μg/mL下，MSD的a隨取代時間延長而增大，最終斜率也為1，但是MSD較β-lg小一個量級。隨著蛋白質量濃度的增加，MSD的斜率a變化減慢，但最終斜率比β-lg的更小。
由上述結果可以看出，蛋白聚集體形成的界面比β-lg更難被膽鹽取代，其中β-lg NP抗膽鹽取代能力最強。原因可能是膽鹽與蛋白及其聚集體在pH 7條件下都帶負電荷，其中β-lg NP電荷量最大。當膽鹽吸附至界面時，β-lg與β-lg NP蛋白分子之間存在較強的靜電相互斥力，這也有可能減緩膽鹽向界面吸附的速度。另外，球形顆粒狀物質在界面有較高的能壘，因此從界面脫附很困難，這也抑制了膽鹽的取代。
3.2 界面膨脹流變學分析結果
圖7為不同質量濃度的β-lg、β-lg NP、β-lg F被膽鹽取代後油-水界面壓（π）的增加量（Δπ）及界面膨脹模量的減少量（ΔE）。圖7A、B中，隨著蛋白質量濃度的增加，對不同蛋白界面均有Δπ降低，ΔE減小；對比β-lg、β-lg NP、β-lg F，發現相同質量濃度下β-lg NP的Δπ最大，ΔE最小，而β-lg的ΔE最大的是β-lg。說明在相同的膽鹽質量濃度下，隨著蛋白質量濃度的增加，膽鹽取代能力降低。綜上，β-lg NP抵抗膽鹽取代能力最強，其次是β-lg F，β-lg最弱。產生此結果的原因可能是因為聚集體疏水性較強形成的界面膜強度較大，抵抗膽鹽取代能力較β-lg強。β-lg NP抵抗膽鹽取代能力最強是因為β-lg NP被取代需要更大的自由能（ΔG）。經計算，得到β-lg NP的ΔG大約為830 kJ，β-lg F的ΔG大約為658 kJ。
4 不同聚集形態蛋白質乳液的消化動力學分析結果
結果顯示，在模擬脂肪消化中，隨著消化時間的延長，3種蛋白質乳液的脂肪酸釋放率逐漸增大。在相同含油量條件下，β-lg聚集體乳液體系脂肪消化速率低於天然蛋白乳液，其中β-lg NP乳液的脂肪消化速率最低。在脂肪消化過程中，膽鹽與界面處蛋白質相結合，降低膽鹽活動能力，進而影響脂肪消化速率。所以可以看出，在相同含油量的條件下，抗膽鹽取代能力依次為β-lg NP＞β-lg F＞β-lg，與微流變實驗結果一致。同時通過對不同形態蛋白質穩定的乳液的穩定性分析（結果此處未展示），發現蛋白聚集體乳液的穩定性較天然蛋白更強，這與微流變測得的模量和界面流變學測得的模量大小趨勢也一致。
結 論
蛋白質動態吸附過程的瞬時信息捕捉存在一定困難，本實驗利用示蹤粒子微流變學觀察到3種形態蛋白質在油-水界面的實時微觀流變信息。結果發現：1）3種形態的蛋白質均可以向界面吸附，形成具有一定黏彈性的界面膜，且吸附成膜是一個動態過程；2）蛋白聚集體呈現出較強的界面活性，其在油-水界面吸附過程比β-lg快，β-lg NP吸附速度最快；3）蛋白聚集體形成的界面蛋白膜具有更強的黏彈性；4）β-lg NP抵抗膽鹽取代能力最強，其次是β-lg F，β-lg最弱。微觀流變學觀察到的結果與膨脹流變學以及體外消化結果一致，說明了蛋白質聚集體在界面活性以及控制油脂消化方面的優勢。
本文《利用示蹤粒子及膨脹流變學研究β-乳球蛋白聚集體的界面行為》來源於《食品科學》2020年41卷17期35-44頁，作者：葉晶，李靜，張嶽梅，黃萍，王倩，高志明，楊楠，NISHINARI Katsuyoshi，方亞鵬。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190819-197。
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