針對實體瘤腫瘤免疫療法受限主要來源於兩點：1、免疫細胞進入實體瘤微環境受限；2、腫瘤免疫抑制的微環境。此次整理分享的文章發現了MDSC（起免疫抑制作用）進入結腸癌腫瘤微環境的機制，具體內容如下：
先造模，作者想研究KRAS突變（G12D）對腫瘤免疫的影響，設立了兩組：iAP組-未突變結腸癌，iKAP組-Dox誘導KRAS突變的結腸癌（GFP是誘導突變時導入的報告分子）。鏡檢和組織切片反映兩類腫瘤細胞在小鼠體內生長進度相當，iKAP組由於用Dox誘導了突變所以IHC結果會有GFP（報告分子）及p-ERK（MRAS下遊）陽性
分別取兩組小鼠腫瘤，分析免疫細胞組成，發現iKAP組（KRAS突變）免疫細胞總體浸潤高於iAP組，T細胞浸潤較少，而MDSC浸潤顯著高於iAP組，暗示KRAS突變和MDSC、T細胞浸潤存在相關性
撤去Dox一周後，KRAS突變消失（IHC圖上GFP不再表達），T細胞浸潤增加，MDSC浸潤減少，再次暗示KRAS突變會抑制T細胞浸潤、促進MDSC浸潤（流式、IHC兩種方法確認）
T細胞中Treg和MDSC一樣發揮免疫抑制的作用，KARS突變後進一步分析Treg發現Treg浸潤也減少，突變消失後Treg浸潤恢復。在TCGA資料庫裡挖掘數據發現，在人結腸癌上KRAS突變後Treg浸潤也會減少，暗示KRAS突變腫瘤中MDSC是發揮免疫抑制作用的細胞
MDSC高表達免疫抑制性分子ARG1和iNOS，會抑制T細胞增殖、分泌IFN-γ
正著看完MDSC可以抑制T細胞後又反著看：抗體敲除MDSC後T細胞浸潤增加
上面的數據充分說明KRAS突變會引起MDSC浸潤增加，進而抑制T細胞浸潤、增殖、發揮效應，那KRAS突變通過什麼對MDSC產生的影響呢？作者選用ingenuity pathway analysis (IPA) of RNA sequencing (RNA-seq) profiles這種基因組學大數據方法比對KRAS突變後腫瘤細胞自身信號通路的變化：發現KRAS未突變組iAP IFN-γ及IFN-α通路高於iKAP組
iKAP組撤去Dox後對RNA測序結果進行IPA分析（由於撤去了Dox，KRAS突變消失，會有一些通路發生上調），發現IFN-γ及IFN-α通路在KRAS突變消失後上調明顯
qPCR結果也說明撤去Dox，突變消失後IFN通路出現上調，暗示KRAS突變和IFN通路存在關聯
再進一步，作者想篩出KRAS突變後所抑制IFN通路的核心基因，將三類變化的基因(i) IFN-α and IFN-γ signature genes (n = 223); (ii) differentially expressed, invasive versus non-invasive (n = 5,727); (iii) mutually exclusive with KRAS mutation (n = 56)進行了交叉比對，找到了IRF2
對TCGA資料庫中腫瘤細胞基因變化進行了篩選，也發現伴隨KRAS突變IRF2出現deletion
基因層面篩出KRAS突變會使IRF2下調，在組織蛋白層面進行驗證發現：KRAS突變後IRF2表達下調，撤去Dox解除突變IRF2恢復表達，暗示KRAS突變會抑制IRF2
相當於找到了KRAS突變的「下遊」IRF2，那IRF2的下遊呢？作者讓細胞過表達了IRF2，看哪些基因表達出現上調，上調的基因包括IFN signaling molecules (STAT1, STAT2, IRF9, IRF7), host defense-related regulation of immunity (RTP4, IFITM1, IFIH1, IFI44, PARP14, NMI, SAMD9L), antigen presentation (PSMB9, PSMB10, B2M), cell death (CASP7, CASP1)，此外ChIP-seq發現很多IRF2結合的位點和IFN通路對應，暗示IRF2是KRAS突變影響IFN通路的主要調節者
做了這麼多實驗發現KRAS突變會使MDSC浸潤增加，KRAS突變抑制IRF2，那IRF2和MDSC浸潤是否相關呢，做新的實驗：在體外，撤去Dox後MDSC遷移減少，讓細胞表達IRF2後MDSC遷移也減少，初步說明IRF2和MDSC遷移存在相關性
剛剛正著看到IRF2抑制MDSC遷移，開始反著看，沉默IRF2後，體外MDSC遷移能力提升，體內也觀察到MDSC浸潤增加，暗示IRF2對MDSC浸潤存在調節作用
是什麼將腫瘤細胞內部的IRF2和MDSC細胞聯繫起來的呢？細胞因子、趨化因子對於免疫細胞召集起重要作用，文章作者將突變後RNA-seq發現的表達發生上調的細胞因子、趨化因子和IRF2 ChIP-seq發現的IRF2結合的細胞因子、趨化因子基因交叉比對，發現CXCL3啟動子上有IRF2的結合位點（E），過表達IRF2後結合的CXCL3增加（F）。進一步驗證實驗發現撤去Dox，KRAS突變消失後CXCL3表達下調，在腫瘤細胞上表達IRF2也會使CXCL3表達下調– KRAS突變抑制IRF2，IRF2抑制CXCL3，KRAS突變促進CXCL3的表達
有一系列趨化因子可召集MDSC，但KRAS突變後只有CXCL3上調最為明顯，暗示CXCL3發揮召集MDSC的作用
沉默腫瘤細胞的CXCL3後MDSC向腫瘤細胞條件培養基遷移顯著減少，向培養基中加入重組的CXCL3後MDSC的遷移顯著增加，再次暗示CXCL3對MDSC遷移存在調節作用
CXCL3的受體是CXCR2，免疫螢光檢測發現MDSC的確表達CXCR2，用抗體或小分子阻斷CXCR2後MDSC的遷移顯著減少
體內實驗發現用小分子SX-682阻斷CXCR2後MDSC浸潤減少，T細胞浸潤增加，同時還使腫瘤細胞減少
至此初步理出了一條線路KRAS突變會抑制IRF2，IRF2通過抑制CXCL3分泌抑制MDSC通過CXCR2的浸潤，作者開始把這條線路中的角色摘出來一個一個的驗證，首先是IRF2，選取MC38細胞系（KRAS通路正常，IRF2表達正常）、MC38K為KRAS突變細胞（可見ERK磷酸化的上調，IRF2表達受抑制）、MC38KI（KRAS突變同時強制表達IRF2，三種細胞中IRF2水平最高），可見KRAS突變後（MC38K組）IFN通路受抑制、CXCL3表達增加、MDSC浸潤增加，突變KARS細胞強制表達IRF2後（MC38KI組）IFN通路回調、CXCL3表達下調、MDSC浸潤減少
強制表達IRF2除可減緩MC38K腫瘤的生長速度、延長小鼠存活時間外，還可以提高MC38K腫瘤對PD-1療法的敏感度
看IRF2之外另一關鍵節點CXCR2，可見用小分子SX-682阻斷CXCR2對腫瘤免疫、腫瘤生長抑制、小鼠存活存在積極作用
綜上，作者理出了這樣的機制：KRAS突變抑制IRF2後，CXCL3的抑制被解除，表達上調，召集MDSC抑制殺傷性T細胞，這一結論是由小鼠模型推導得來，為放大研究的意義，在人的樣品、資料庫中又挖掘了一番 - KARS突變腫瘤IRF2表達低、對PD-1療法的響應與IRF2表達正相關
以往我們只關注腫瘤細胞本身，挖掘腫瘤細胞相較正常細胞到底哪出了問題，如：哪個蛋白突變了、哪條通路過度激活了、哪條通路受抑制了，找到腫瘤身上的問題之後試圖直接在腫瘤細胞上進行糾正。腫瘤免疫療法是一種新的視角，在和腫瘤細胞這臺戲裡我們又引入了新的角色-免疫細胞，這篇文章從這個視角出發去挖掘腫瘤細胞本身發生的「變化」對新角色免疫細胞產生的影響，工具、方法、模型其實就那麼多，掌握這些只是必要的開始，更重要的還是講故事的人的思維、視野。
Wenting Liao, Michael J. Overman, Adam T. Boutin, et al. KRAS-IRF2 Axis Drives Immune Suppression and Immune Therapy Resistance in Colorectal Cancer [J].Cancer Cell, 2019.
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