青海省民和縣喇家遺址出土漢代馬骨的DNA 初步研究

摘要：運用古DNA技術對青海省民和縣喇家遺址漢代灰坑中出土的8匹馬的骨骼進行了遺傳學分析，通過提取DNA並對線粒體DNA和毛色控制基因的核DNA進行PCR擴增和測序，全部樣本都獲得了線粒體12SrRNA基因的部分DNA片段，序列分析結果表明喇家遺址這8例漢代馬骨均屬於家馬的範疇。其中6個個體還獲得了線粒體DNA控制區序列，在這6個序列中共檢測出5個不同的單倍型，歸屬3個不同的譜系A、D和F。毛色控制基因的SNP檢測結果顯示該遺址漢代家馬的毛色有棗色（bay）、慄色（chestnut）和黑色（black），都是常見的屬於純色的馬匹毛色。本文的家馬毛色研究發現中國古代家馬毛色多樣性是從西向東逐漸遞減的，從另一個側面反映出經新疆、甘青入中原地區是古代家馬進入中國的一條主要路線。作為絲綢之路的一部分，喇家所在的甘青地區有著獨特的地理位置，位於中原地區和新疆地區之間，是家馬從新疆到中原的經由之路。本文的馬骨DNA研究為進一步深化甘青地區的考古學研究提供了新的材料。

喇家遺址位於青海省民和縣官亭鎮喇家村，地處黃河上遊的官亭盆地，坐落在黃河河谷地帶北岸的二級階地上。地理坐標為北緯35°42′～37°09′，東經101°05′～103°01′，是我國首次發掘的大型史前災難遺址。該遺址一系列重要考古發現引起了國內外學者的廣泛關注，例如喇家遺址發現了目前世界上最早的「麵條」；房址內發現數量不等人骨，姿態各異，一組組呈不同姿態分布於居住面上，有的相擁而死、有的倒地而亡、有的匍匐在地、有的母子相依等。2015年7月至12月，青海省文物考古研究所聯合四川大學考古系、喇家遺址博物館對喇家國家考古遺址公園即將施工區域進行了發掘，又發現了齊家文化、辛店文化和漢晉時期遺存，以齊家文化遺存為主。漢晉時期遺蹟包括灰坑55個，灰溝2條。漢代遺物有陶器、鐵器、骨器、玉石器、銅錢等。漢代遺蹟填土多為灰黑土，其內夾雜大量動物骨骼，也浮選出較多植物種子。

作為絲綢之路的一部分，喇家地區也應該是一個重要的「東西交流」的通道。喇家遺址距離著名的「臨津古渡」只有7公裡。「臨津古渡」始於漢代，繁榮於唐宋時期，從漢到明、清以及近代一直是黃河上遊的重要渡口，可以西進新疆、南入西藏。「臨津古渡」所在的甘青地區是溝通中原和新疆的通道，文化上是聯繫中西文化的橋梁，在歷史上發揮著重要的作用。

中國現在所見的家馬應該是在青銅時代最早從境外交流進來的。考古學證據表明，家馬遺骸最早發現於烏克蘭的Dereivka和哈薩克斯坦的Botai遺址，中亞地區是家馬起源、馴化、並向外擴散的中心地區。甘青地區應該是這種交流的經由之地，而且這種交流可能是持續的，比如有文獻記載稱，通過絲綢之路，漢武帝派人到中亞找尋「天馬」或「汗血寶馬」。作為黃河上遊少數幾個主要的古渡口之一，「臨津古渡」及周邊地區在歷史上也可能是「東西交流」的重要集散地之一。喇家遺址出土的漢代馬骨遺存為我們研究「臨津古渡」開始使用時期可能用於集散的古代家馬的特點提供了材料。

本文以青海省民和縣喇家遺址出土漢代馬骨為研究對象，用古DNA的研究方法，揭示該地區漢代家馬的遺傳結構特點，並與甘青周邊地區以及中國其他地區古代家馬進行比較。本文研究也期望為今後甘青地區大樣本的古代家馬DNA研究提供新的數據。

一、材料與方法

1、樣本採集

在動物考古學家進行種屬鑑定等形態學研究的基礎上，本文對喇家遺址2015年發掘出土的8例馬骨樣本進行了採集，採集部位均為骨質保存較好的肢骨。這8例馬骨全部是出於灰坑中的破碎骨骼，而不是完整的馬骨架，的年代均為漢代，樣本的具體信息見表一。

2、樣本處理與DNA提取

首先取馬骨上約1cm×1cm見方的小塊，用鑽頭打磨骨骼表面和截面以去除骨骼表面塵垢，次氯酸鈉溶液（有效氯6％）浸泡和紫外照射（紫外燈置於樣本以上8cm的高度，波長254nm，），用以去除骨骼表面的外源DNA汙染。之後使用冷凍研磨機打磨成粉。在此基礎上採用Yang等提出的矽柱離心法進行DNA提取。

3、DNA擴增與測序

首先，選擇引物L1269/H1346擴增線粒體基因組中12SrRNA基因，對所選樣本進行初步種屬鑑定。在此基礎上，本文選擇了蔡大偉等設計的兩對套疊引物來擴增古代家馬的線粒體DNA控制區的DNA片段（15473~15772，包括引物長度），優化選擇使用Ludwig等已發表的引物來擴增毛色控制基因的核DNA片段。全部擴增產物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。PCR陽性產物送到測序公司（Invitrogen）直接測序，正反引物雙向測序。在全部實驗過程中，嚴格按照防汙染措施操作，具體實驗操作詳見。

4、數據分析

PCR產物所得到的序列使用Chromas Pro軟體進行讀取，通過ClustalX2軟體進行序列比對，並使用BioEdit進行編輯。使用Network5.0軟體構建中介網絡圖，選擇中國考古遺址出土家馬（見表四）作為對比序列，詳見圖一。

二、結果

1、線粒體DNA序列變異情況及單倍型類群歸屬

其中，有6個古代馬骨樣本都獲得了線粒體DNA控制區的262bp序列（15493~15754，去除兩端引物）。以X79547作為參考序列進行比對，實驗結果見表二。共檢測出14個多態性變異位點，全部為轉換，沒有顛換、插入與缺失，且轉換主要在嘌呤之間，佔57.1%（8/14）。另外2個古代馬骨樣本（EQC224與EQC226）雖然也獲得了線粒體DNA控制區的序列，但是多次DNA提取得到的序列結果不能完全匹配，因此本文將這2個樣本的實驗結果確定為失敗。所獲得的6個序列中共檢測出5個單倍型，其中EQC229與EQC230共享同一單倍型。根據Jansen等、McGahern等的關於單倍型類群的劃分，基於線粒體DNA序列變異模式，本文的5個單倍型可以歸屬於單倍型類群A6、D2、D3和F3，詳見表二。

2、毛色控制基因的SNP位點檢測

依據以前研究，本文亦選擇常見的和研究相對較深入的6種毛色控制基因的8個SNP位點進行檢測，包括MC1R(g.201)、ASIP(g.2183~2193del)、MATP(g.72)、KIT(g.786)、KIT(g.1120)、SILV(g.1457)、SILV(g.697)、EDNRB(c.323_333)，其野生型為E/E、A/A、C/C、KM0/KM0、sb1/sb1、z/z、z/z、ov/ov。

本文選擇的8個古代馬骨樣本中，有6個樣本獲得了全部SNP變異結果，另外2個樣本（EQC224與EQC226）獲得了部分SNP變異結果，由於這2個樣本所得SNP位點結果太少無法對毛色進行推測，因此下文中不再對其進行討論。毛色控制基因的SNP位點檢測結果詳見表三。在本文檢測的6個樣本中，有1個樣本（EQC227）的基因型與野生型相同，其餘5個樣本的基因型與野生型不同，但是發生變異的只有MC1R(g.201)和ASIP(g.2183~2193del)兩個基因位點，控制的表型分別為慄色（chestnut）和黑色（black），其他基因位點MATP(g.72)、KIT(g.786)、KIT(g.1120)、SILV(g.1457)、SILV(g.697)和EDNRB(c.323_333)未發生變異。

結合已有的關於家馬毛色基因的研究，根據本文毛色基因SNP位點的檢測結果及其所控制的表型特徵，對喇家遺址出土的這6匹古代馬的毛色進行推測：EQC227、EQC229和EQC230應該是棗色（bay），EQC225和EQC231應該是慄色（chestnut），EQC228應該是黑色（black）。

三、討論

1、線粒體DNA研究

為了便於和以往已經發表的中國古代家馬線粒體DNA單倍型類群進行對比分析，本文仍然依據Jansen等與McGahern等的命名原則和劃分方法。以此，本文從6個個體中檢測到5個線粒體DNA單倍型，分別可以歸屬於譜系A、D和F，進一步細分分別歸屬於單倍型類群A6、D2、D3和F3。在現代家馬群體譜系中，B、C、E和G的分布頻率普遍較低，但A、D和F的分布頻率較高。顯然喇家漢代家馬的線粒體DNA單倍型歸屬於現代家馬常見的譜系，而且這6個個體的線粒體DNA單倍型中沒有檢測到屬於普氏野馬的單倍型類群A2。全部8個個體的線粒體12SrRNA基因的部分DNA序列結果表明，喇家遺址這8例漢代馬骨均屬於家馬的範疇。

將已有研究成果與本文結果進行統計與比較（見表四和圖一）。目前中國古代家馬的線粒體DNA控制區序列已經達到65個（九龍山JLS02H只有部分序列不能進行單倍型類群劃分，在此未加入統計分析），可以歸屬於譜系A（A1、A3、A4、A6、A7）、B（B2）、C（C1、C2）、D（D2、D3）、E、F（F1、F2、F3）和G，表現出非常高的線粒體DNA遺傳多樣性。

根據已經發表的中國古代家馬DNA研究成果，本文依據遺址所處地理位置，為了便於地區之間的比較，將這些遺址劃分為四個區，新疆地區（包括平頂山和石人子溝）、甘青地區（包括喇家、於家莊、豐臺、九龍山和中莊）、內蒙古長城地帶（包括大山前、井溝子、板城、小雙古城和新店子）和中原地區（包括毛園和棗樹溝腦）。雖然這些遺址所處的時間範圍非常大（從距今4000年至漢代），但是都不晚於喇家漢代家馬的年代，因此有著很好的可比性；雖然這些遺址分布的地域範圍非常廣，從東北到西北，但是喇家和這些地區的家馬之間應該有著某種「淵源」關係。

作為甘青地區的一部分，可以很好地理解喇家家馬和甘青地區的家馬關係更近一些。由於甘青地區和新疆地區及內蒙古長城地帶之間有著長期經常性的文化和群體交流，同樣可以理解喇家家馬和這些地區的家馬也有著比較接近的關係。中原地區的家馬是常年不斷的從甘青地區引進的，應該和這些地區的家馬是密切關聯的。但是如果中原地區是引進的終點，沒有反向的交流，長此以往，中原地區家馬就會演變出一些獨特的群體遺傳特點。此外除了從甘青地區引進家馬，也許還存在其他的途徑將家馬引入到中原地區。因此相比較而言，喇家漢代家馬和中原地區家馬的群體遺傳結構也許會有更多的差異。當然，本文研究的樣本量太小，這些觀察需要進一步的研究得以證實。

2、毛色研究

有研究認為，在家畜馴化過程中，對動物本身而言有一個人為選擇取代自然選擇的過程。在家馬引進選擇的過程中，一些形態和行為特徵可能會成為人為選擇的標準，例如毛色。Ludwig等對歐亞大陸發現的古代馬的毛色進行了SNP檢測，發現距今5000年以來，在西伯利亞與東歐地區家馬毛色的多樣性迅速且持續地增加。因此推測毛色多樣性的出現，很可能反映當時人們有計劃地選擇、改進或引進新品種。

喇家遺址的漢代灰坑中出土的家馬骨骼，可以確定的毛色有棗色（bay）、慄色（chestnut）和黑色（black），都是常見的屬於純色的馬匹毛色，未發現有帶白斑的基因突變。目前關於中國古代家馬毛色的研究還比較少，目前已發表的有4個遺址：青海豐臺遺址的4匹家馬有3匹棗色（bay）、1匹棗色帶有白斑（bayTobiano）；陝西棗樹溝腦遺址馬坑出土的4匹家馬有3匹棗色（bay），另一匹的主要毛色可能為棗色（bay）或黑色（black）不能確定是否存在斑點狀紋飾；新疆石人子溝遺址的5匹家馬有3匹慄色（chestnut），其餘2匹分別為棗色（bay）和金黃色（palomino）；新疆平頂山墓群的8匹馬有3匹慄色（chestnut）、2匹慄色有白斑（chestnut tobiano）、2匹黑色（black）、1匹金黃色（palomino）。

與同屬於甘青地區的豐臺遺址相比，年代較晚的喇家遺址的家馬毛色相對多樣，推測隨著時間的發展，有可能引進了新的馬匹品種，也有可能引進了新的育種技術。如果仍然將這幾個遺址按地域進行劃分來看不同地區古代馬的毛色多樣性變化，新疆地區馬的毛色最豐富，甘青地區次之，中原地區最少。中原地區僅有棗樹溝腦一個遺址共4匹馬的材料，與其他地區相比樣本量非常少，可能存在樣本數量的偏差。但是從總的趨勢可以看出來，古代家馬毛色多樣性是從西向東逐漸遞減的。一般認為，生物擴散或遷徙的結果是原地區群體的遺址多樣性要比新進入地區的高，這是因為在擴散或遷徙過程中，總有一些個體或亞群體保留在原地未遷出。因此本文研究結果從側面反映出經新疆、甘青入中原地區是中國古代家馬進入中國的一條主要路線。

喇家遺址所在的甘青地區位於中原地區和新疆地區之間，這一區域相對獨立，呈走廊狀，地理上是溝通中原和新疆的通道，文化上是聯繫中西文化的橋梁，在歷史上發揮了重要的作用。甘青地區處於乾旱、半乾旱地帶，對生產力有限的史前人類而言，經濟方式很大程度上受氣候的影響。當氣候適宜的時候可以發展農業，當氣候條件惡劣的時候農業生產會受到很大影響。有學者認為距今4000年前後由於受氣候變化的影響，甘青地區的生業模式開始由農業或半農半牧向以牧業為主轉變，馴化家馬的引入加速了甘青地區史前人類生產經營模式的轉變。

西漢武帝派張騫出使西域，即以長安（今西安）為起點，經甘肅、新疆，到中亞、西亞，聯結地中海各國的陸上通道，經此絲綢之路，馴化的家馬會源源不斷東進到達中原地區。黃河上遊的重要渡口「臨津古渡」，可能就是絲綢之路過黃河的幾個重要通道之一。如果古代文獻記載可靠，引進的「天馬」或「汗血寶馬」很有可能是經由此地進入當時的中國內地的。

「汗血寶馬」在中國歷史文獻上有提及，但現代生物學上估計很難科學地對此馬進行定義，因此目前也尚無現代DNA標記來識別「汗血寶馬」。古DNA研究尤其是古代線粒體DNA對該問題目前是「無能為力」的。今後如果現代遺傳學研究能夠識別並標記出現代的「汗血寶馬」，那麼運用大規模測序技術（Next Generation Sequencing），對漢代家馬進行大樣本量的古DNA基因組研究，則有可能證明歷史上漢武帝派人到中亞尋回「天馬」或「汗血寶馬」的故事。若如此，本文喇家漢代家馬以及其他古渡地區的漢代家馬DNA樣本就可能是研究「汗血寶馬」的首批材料。

四、結論

通過對青海喇家漢代灰坑中出土的馬骨進行線粒體DNA和毛色控制基因的核DNA分析，本文得出以下認識：

DNA分析揭示喇家出土的漢代家馬的線粒體DNA群體遺傳特點顯示出其為常見的線粒體單倍型類群，和甘青地區其他遺址的家馬表現出非常近的親緣關係，與新疆地區和內蒙古長城地帶（包括中原地區）的古代家馬沒有很大的差異，反映出喇家所在的甘青地區在溝通中原地區和新疆地區中所處的獨特地理位置，甘青地區也因此成為家馬從新疆到中原的經由之路。

毛色控制基因的核DNA研究顯示喇家遺址出土家馬的毛色有棗色（bay）、慄色（chestnut）和黑色（black），都是常見的屬於純色的馬匹毛色。通過與其他遺址出土家馬毛色進行比較發現，中國古代家馬毛色多樣性是從西向東逐漸遞減的，從側面反映出經新疆、甘青入中原地區是中國古代家馬進入中國的一條主要路線。

致謝：感謝青海省文物考古研究所、四川大學考古系、喇家遺址博物館為本研究提供了寶貴的樣本。

責編：荼荼