趙遠錦/商珞然《先進材料》仿生清潔的多孔凝膠顆粒及微流控晶片

【科研成果】

通過吸附過量的bio分子來淨化blood對於維持人類healthy至關重要。受kidney自我淨化技術的啟發。11月，東南大學趙遠錦/復旦大學商珞然教授團隊提出了一種可以同時去除許多不同大小的Bio分子技術，並論述了與人字形微流控晶片集成在一起的分級分子印跡反蛋白石顆粒，以進行有效的Bio分子清潔。該顆粒具有組合的多孔結構，具有表面和內部印記，可特異性識別小分子和bio大分子。另外，由於增強了混合，人字形混合器的存在大大提高了吸附效率。此外，顆粒的反蛋白石框架提高了光學感應能力，可自我報告吸附態。這些功能，以及其可重複使用性，bio安全性和bio相容性，使得該平臺在臨床血液淨化和人工kidney構建方面極具前景。相關論文Hierarchically Molecular Imprinted Porous Particles for Biomimetic Kidney Cleaning發表再《Advanced Materials》上

【圖文解析】

作者提出了一種血液淨化平臺，該平臺在人字形微流體混合器中嵌入了分子印跡的多孔顆粒，如圖1所示。微流體通道由帶圖案的微槽組成，可通過產生流體的螺旋運動來提高混合效率。因此，它已廣泛用於bio（化學）反應和分析。但是，人字混合器在blood淨化中的應用尚未得到充分的探索。有鑑於此，引入分子印跡聚合物反蛋白石顆粒（MIPIOPs）作為嵌入通道中的吸附劑。蛋白石反顆粒由以六角形密堆積方式排列的周期性有序，相互連接的微孔組成。儘管豐富的孔為吸附提供了足夠的表面積，但是如果不建立分子識別機制就無法實現選擇性吸附。通過與分子印跡策略整合，顆粒具有較小的印跡分子空間腔和較大的反蛋白石結構孔。具有定製結合位點的這種分層結構的顆粒已用於生物分子的特異性識別。但是，以前的MIPs研究僅集中在單分子印跡上，其在流體環境中的作用尚未得到充分證明。

圖1 a）kidney同時淨化不同大小bio分子的自我淨化功能示意圖。b）嵌入人字形微流控晶片中的MIPIOP用於多種blood bio分子清潔的機制。

具有多個分子結合位點的MIPIOP首先通過組合印跡過程製備，如圖2a所示。具體而言，首先通過在微流體乳液液滴中密閉組裝來製備二氧化矽膠體晶體珠（SCCB）。SCCB表面的二氧化矽納米顆粒具有豐富的矽烷醇基團，因此能夠吸收帶正電荷的矽醇lysozyme通過靜電相互作用。SCCB表面的大分子lysozyme充當印跡模板，在聚合物基質中形成「分子印跡」。在這裡，lysozyme功能化的SCCB在甲基丙烯酸明膠（GelMA）和聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）的預凝膠混合物中溶脹，直到二氧化矽納米顆粒之間的空隙被完全填充。然後，將預凝膠溶液在紫外線（UV）下聚合，通過氫氟酸蝕刻除去SCCB，然後用磷酸鹽緩衝液（PBS）衝洗印跡的lysozyme分子。所得的MIPIOP具有分級的多孔結構，其具有由壓印分子產生的小空間空腔和反蛋白石骨架的大空隙。此外，將包括尿素和肌酸在內的小分子加入到預凝膠溶液中，並印在水凝膠框架的內部。因此，所得的MIPIOPs不僅具有表面lysozyme的結合位點，而且還具有內部的尿素和肌酸的結合位點。由於結構是有序的，所以SCCB，水凝膠填充的雜化SCCB和複製的MIPIOP都顯示出鮮明的結構顏色，如圖2b-d的光學顯微鏡圖像所示。如圖2e–g所示，這些粒子的此類3D有序微觀結構已通過掃描電子顯微鏡（SEM）得以確認。

圖2 組合MIPIOP的方案和特性。a）組合式MIPIOP的製造過程示意圖。b–d）lysozyme功能化SCCB（b），分子印跡水凝膠雜化SCCB（c）和MIPIOPs（d）的反射顯微圖像。e–g）lysozyme功能化的SCCBs（e），分子印跡水凝膠雜化SCCBs（f）和MIPIOPs（g）的SEM圖像。比例尺在（b–d）中為250 µm，在（e–g）中為200 nm。

作為概念驗證實驗，MIPIOP用於同步吸附大分子溶菌酶和小分子尿素和肌酸。血液中尿素的濃度已被廣泛用作kidney disease的檢測指標。但是，單一指標往往不足以診斷某些與kidney disease相關的complication disease。尤其是，血清lysozyme的檢測將有助於提高某些complication disease的診斷準確性。同時，測量血清中肌酸的濃度可能有助於反映人體的健康狀況。因此，在這裡選擇尿素，肌酸和lysozyme作為三個印跡目標，包括小分子和大分子。因為可以在水凝膠基質中維持印跡分子的空間結構，所以MIPIOPs可以特異性識別和吸附相應的分子。作者通過使用紫外可見光譜法測量這三個分子隨時間的吸附來證明這一點。如圖3a–c所示，三種生物分子的吸附在大約一小時內達到平衡，表明印跡腔中的各個分子已飽和。目前的MIPIOPs的吸附能力與現有的吸附材料相當，後者對目標bio分子具有極好的親和力。使用異硫氰酸螢光素（FITC）標記的lysozyme作為指示劑，比較了MIPIOPs和普通反蛋白石（無分子印跡）之間的吸附能力。進一步採用了一系列優化過程來提高MIPIOP的吸附效率。為了吸附lysozyme，用十二烷基磺酸鈉（SDS）處理了SCCB，以增加二氧化矽納米顆粒的表面電荷並增強與lysozyme的靜電相互作用。然後，測量了吸附FITC lysozyme後，經SDS處理的SCCBs產生的MIPIOPs的螢光強度。已發現，隨著一系列SDS處理時間和螢光強度曲線所表徵，吸附隨著SDS處理時間的增加而增加。lysozyme的Zeta電位（+24.93 mV）支持了二氧化矽納米顆粒與lysozyme之間的靜電相互作用。為了吸附尿素和肌酸，優化了印跡分子的濃度。儘管吸附能力隨分子濃度的增加而提高（圖3d），但鑑於bio分子在預凝膠溶液中的溶解度，最大濃度被限制為15 wt％。此外，作者在預凝膠溶液中添加了丙烯酸（AA），從而在MIPIOPs的水凝膠骨架上提供了豐富的羧基，如圖S5中的傅立葉變換紅外光譜（FTIR）所表徵。因此，隨著AA濃度的增加，吸附得到了改善（圖3e），從而證實了MIPIOP與目標分子的親和力。然後我們研究了僅印有單個分子（即尿素或肌酸）的MIPIOPs的選擇性吸附能力。結果表明，印有某種類型的bio分子的MIPIOPs僅顯示對相應靶標的強吸附，如圖3f所示。

圖3 MIPIOP的吸附能力。a–c）lysozyme（a），尿素（b）和肌酸（c）的吸收值隨浸泡時間的變化而變化。d）不同尿素和肌酸濃度對尿素和肌酸的吸附能力。e）對三種丙烯酸濃度不同的bio分子的吸附值。f）兩種不同的MIPIOP對各自印跡分子的比吸附能力。由羧基在水凝膠骨架上的吸附能力引起的少量非特異性吸附可以忽略不計。

將MIPIOPs吸附劑嵌入微流控晶片中，以選擇性清潔血液中的多種bio分子。微流控晶片經過專門設計，將微腔室的底層和人字形混合器的頂層粘合在一起，如圖4a所示。人字形混合器由一個微通道組成，該微通道具有以60°角定向的圖案化微槽，如圖4b所示。微腔室由嵌有MIPIOP的六角形圖案化微柱組成，其中每個MIPIOP均被三個微柱分別隔開，如圖4c所示。整個微流控設備的光學圖像如圖4d所示。將該平臺應用於nephropathy患者模型血液樣本中ysozymel，肌酸和尿素的同步吸附。吸收FITC lysozyme後，微流控設備中MIPIOPS的明場和螢光圖像證實了每個微腔室是一個單獨的吸附單元。整個吸附測量為所有單元的總和，其結果示於圖4e。因此，它證明了集成MIPIOPs的微流控晶片在臨床血液淨化中的吸附能力。

圖4 a）雙層微流控晶片的製造過程示意圖。b）微流體晶片頂層的光學圖像（頂部面板）和人字形微槽結構的細節（底部面板）。c）微流控晶片底層的光學圖像（頂部面板）和微腔室的細節（底部面板），這些微腔室由嵌入了MIPIOP的帶圖案的微柱組成。d）整個MIPIOP集成了人字形微流控晶片的光學圖像。e）在蒸餾水和serum中，微流體平臺對三種bio分子的清潔效率。比例尺在（b）中為200 µm，在（c）中為250 µm。

值得注意的是，人字形通道設計為產生湍流，這將增強目標bio分子與MIPIOP之間的接觸。為了證實這一點，通過數值模擬解決了人字形微通道中的流體流線。流體表現出旋轉和扭曲，如微流體通道的垂直（圖5a，b）和水平橫截面的速度流線圖所示。如圖5c-e所示，在MIPIOPs集成的微流平臺上，lysozyme，肌酸和尿素的清潔效率顯著高於裸MIPIOPs的清潔效率，尤其是在反覆進行吸附循環後，這一點尤為明顯。

圖5 a）人字形微通道中形成的湍流的數值模擬，b）人字形微流通道垂直截面中的速度流線的數值模擬。c–e）用MIPIOPs和集成MIPIOPs的微流控晶片進行重複吸附循環後，得出lysozyme（c），肌酸（d）和尿素（e）的清潔效率圖。

參考文獻：

doi.org/10.1002/adma.202005394

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