多器官微流控晶片技術及其應用

微流控晶片技術（Microfluidics）也被稱為晶片實驗室（Lab-On-a-Chip, LOC），涉及物理、化學、醫學、流體、電子、材料、機械等多學科交叉的研究領域。通過微通道、反應室和其他某些功能部件，對流體進行精準操控，對生物、化學、醫學分析過程的樣品製備、反應、分離、檢測等基本操作單元集成分析，具有液體流動可控、集成化、消耗低、通量高、分析快等優點，已經被廣泛應用於生物醫學和環境科學等研究領域。基於微流控晶片技術的人體器官晶片（Human organs-on-chips）近幾年來發展迅速，已經實現肺、腎、腸、肝、心臟、血管、皮膚、大腦、骨骼、乳腺、脾臟、血腦屏障、氣血屏障等晶片的構建，通過與細胞生物學、工程學和生物材料等多種學科的方法相結合，體外模擬多種活體細胞、組織器官微環境，反映人體組織器官的主要結構和功能特徵。ahhednc

人體不同器官或整個系統的毒性檢測是藥代動力學和藥效學研究的重要部分，傳統的二維細胞培養模式以及動物實驗取得了諸多成就，但受周期、成本、精準度、倫理等因素的限制，難以預測人體對於各種藥物的響應。研究表明：人體器官晶片技術能準確地控制多個系統參數，與傳統的毒理學動物實驗相比更能反映人體內真實情況，在新藥篩選方面更具特異性。因此，利用微加工技術，建立更接近人體環境的仿生系統成為體外生理模型的研究熱點。ahhednc

然而，隨著器官晶片技術的發展，其應用仍然存在一定的局限性，大部分生理途徑需要連續介質循環和組織間相互作用，單器官晶片無法全面反映機體器官功能的複雜性、功能變化和完整性。為適應人體結構複雜性，未來的研究需要建立更加複雜的多器官微流控晶片（Multi-Organ-Chip, MOC）系統，將幾種器官等同物合併到類似人類的代謝環境中，開發動態的實驗室微生物反應器，進行系統的毒性檢測和代謝評估。ahhednc

本文綜述了近年來多器官微流控晶片的研究進展，並對其發展趨勢進行了展望。ahhednc

多器官微流控晶片的設計原理

多器官微流控晶片將不同器官和組織的細胞在晶片上培養，以微通道相連，實現多器官集成化，以考察其相互作用或建立一個系統，用於體外藥物篩選。晶片中可集成數個經過特殊設計的微培養室、灌注通道並同時培養多種細胞，利用微流控技術可以產生精確可控的流體剪切力、周期性變化的機械力和溶質濃度梯度變化的灌注液。利用這些平臺優勢，多器官微流控晶片可以用於細緻地分析組織、器官特異性應激反應，例如循環免疫細胞的募集、對藥物、毒素或其他刺激因素的應答等。除此之外，將多個模擬不同器官、組織的晶片，按照體內的關係，用血管內皮組織、血細胞或是流體介質將其連接起來，就能在體外模仿體內不同器官、組織之間的生理作用和藥物分布等。ahhednc

圖1所示為 MOC系統裝置，圖1（a）包括兩個聚碳酸酯蓋板，PDMS-玻璃晶片用於承載血流迴路（粉紅色）和排洩流動迴路（黃色）；數字分別代表腸道（1），肝臟（2），皮膚（3）和腎臟（4）組織的4個組織培養隔室。多器官晶片布局的頂視圖示出了血液迴路中的3個測量點（A，B和 C）的位置以及排洩迴路中的兩個測量點（D，E）。該裝置用微泵設備來控制流體的順時針和逆時針流動，以微通道相連接，在晶片上培養構建了可容納腸、肝、皮膚、腎4個器官的MOC系統，通過兩個流動迴路模擬模擬藥物在腸內吸收、肝臟代謝以及腎臟排洩，用於體外檢測候選藥物安全性和有效性評估。應用該系統體外模擬了人體內葡萄糖代謝的環境，結果顯示晶片「口服」藥物，吸收後藥物通過模擬的血液循環，經過肝臟，然後進入皮膚和腎臟，到達腎臟器官模型代謝並經腎尿液排出，進一步驗證了葡萄糖在小腸內的代謝途徑。此外，還有相關研究共培養神經球和肝球體，構建神經系統-肝臟多器官微流控晶片，用2，5-己二酮研究其對組織的毒性作用和代謝途徑，通過測定葡萄糖消耗量和乳酸產量作為MOC系統代謝活動的指標。在肝中，正己烷可能以解毒途徑或者生物活化途徑代謝為己醇，經過血液到達大腦產生毒害作用，實驗中對兩種不同濃度的2，5-己二酮的毒性測定結果表明其誘導了神經球和肝微組織中的高度細胞凋亡。ahhednc

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圖1 多器官微流控晶片設計示意圖ahhednc

多器官微流控晶片系統研究

微細胞培養物類似物（μCCA）與PBPK模型ahhednc

藥代動力學模型（Physiologically Based Pharmacokinetics, PBPK）是指一種更符合藥物在體內動態變化的具體狀況的模型，對於新藥研發具有重要作用。PBPK模型以「生理學室」代替經典模型中的隔室（房室模型），根據質量平衡關係、按模型建立速度方程、對方程組進行求解、得出各個組織或器官的毒物濃度與時間的關係，可基本明確藥物在體內動態增加或減少的實際情況。由於微流體可以精確控制多個隔室的流動和連接，區域化的微流體系統可以作為PBPK模型的體外平臺。ahhednc

經過對多器官微流控晶片系統的研究，開發了一種模擬人類對藥物反應的高通量體外系統，將基於微流控晶片的微細胞培養物類似物（Microscale Cell Culture Analog, μCCA）與PBPK模型結合使用，建立對應PBPK數學模型的物理裝置（μCCA裝置）。在裝置中，每個器官代表一個隔室，代表關鍵器官的腔室被製造在矽晶片上，並通過微通道相互連接用於模擬血液流動中的介質再循環，μCCAs縮小器件可以在體外模擬近生理流體流動條件、體內組織的尺寸比以及多組織器官的相互作用，通過使用外部泵和外部常見的介質再循環來支持個體肝臟、骨髓和腫瘤細胞系培養隔室之間的相互作用。在對肝臟、骨髓和腫瘤細胞系共培養研究中，根據人類組織數據設置縮放細胞室及相關參數，μCCA裝置中不同組織或者器官分別以單獨的隔室相連接來模擬多組織器官的作用環境。實驗結果顯示，μCCA裝置能夠捕獲肝臟隔室中的代謝，可以觀察到傳統孔板測定中未觀察到的腫瘤細胞的損傷。ahhednc

結合PBPK預測的μCCA裝置可以與人體試驗的藥物處理匹配，不僅能模擬動態的多器官相互作用，並且還能夠模擬現實的生理微環境，實現體外研究藥物的藥代動力學等藥效學性質。μCCA裝置的微環境是基於一個簡化的PBPK數學模型設計的，在研究藥代動力學、不同器官細胞間互作及毒性和代謝相互作用的假設檢驗等方面有重要意義。不足的是，當細胞以流體連接的方式培養時，培養基在提供營養物質、去除細胞廢物的同時，也可能會放大未知灌注液對隔室細胞的毒性作用。ahhednc

多通道三維微流控細胞培養系統（3D-μFCCS）ahhednc

由於μCCA裝置的不足，要設計一個體內高度保守的系統，重要的是以流體聯繫的方式培養多種細胞類型，同時保持彼此間的隔離，據此開發了一種多通道3D微流控細胞培養系統（3D microfluidic Cell Culture System, 3D-μFCCS）。ahhednc

3D-μFCCS是由多個微通道相互連接的微流體通道和微陣列組成，採用微陣列技術對多種細胞類型進行高密度物理固定，以獲得最大的細胞-細胞相互作用。在3D球形微組織和微流控技術進行多組織實驗分析中，將預先形成的球形微組織裝載到微室中並在連續灌注下培養，通過自動化的晶片傾斜由重力驅動的流動產生，而不需要額外的管道和外部泵。以3D-μFCCS為基礎構建的鼠肝和大腸腫瘤MOC系統在前體藥物環磷醯胺存在下培養8d，僅在晶片上不同微量組織類型的共培養物中觀察到對腫瘤生長有顯著影響，而環磷醯胺處理的靜態肝臟微組織的不連續轉移上清液並不顯著影響腫瘤生長。該系統驗證了環磷醯胺對腫瘤生長有顯著的影響，但在體外無抗腫瘤活性，只有在肝臟被生物活化之後才起作用。ahhednc

此外，多通道3D-μFCCS還被設計用於同時培養不同器官的細胞聚集體以模擬身體中的多個器官。培養4種不同的細胞類型，以模擬人類的4種器官：C3A（肝臟），A549（肺臟），HK-2（腎臟）和 HPA（脂肪），通過補充常見的培養基與生長因子來優化細胞功能。在細胞培養過程中，特異性地將TGF-β1在A549室內控制釋放，能增強A549細胞的功能，而C3A、HK-2和HPA細胞的功能不受影響，與模擬單個組織功能有所不同。3D-μFCCS裝置上，細胞培養隔室之間有限的相互作用類似於體內的情況。ahhednc

單向流動的生物測定系統及其他MOC系統ahhednc

相比μCCA和3D-μFCCS，Imura及其同事構建的生物測定系統是相對先進的版本，它將人類的腸道，肝臟和乳腺癌細胞系培養物組合成一個單一的線性通道，應用單向流動而不需要介質再循環。微晶片由載玻片，透氣膜和聚二甲基矽氧烷片組成，其中含有通過光刻製成的微通道。將Caco-2克隆結腸腺癌細胞在微晶片的膜上培養，模擬藥物的體內腸轉運：環磷醯胺能透過腸屏障的，表現出較高的滲透係數，環磷醯胺不能被腸壁吸收的，表現出較低的滲透係數。滲透測試結果與使用傳統方法獲得的結果一致，而電池消耗減少80%。ahhednc

近年來，在原有器官晶片系統的基礎上，MOC系統進一步發展完善。Loskill等利用μOrgano系統研究多個心臟單元，可以單獨加載不同類型的細胞，控制分化和發育的時間，控制各個組織的流體連接，即插即用。Maschmeyer等設計了可容納兩個微生物流體流動迴路的MOC裝置，首次實現了腸、肝、皮膚和腎4個器官組織在微流控晶片上重複培養28d，且所有組織在整個共培養期間保持高細胞活力和離散的生理組織結構，成功從生理角度證明了腸道的功能以及腎臟的生物屏障。除了腸屏障與腎屏障，多器官微流控晶片還成功地模擬了人體的多個生物屏障，例如利用Transwell裝置在懸浮於孔中的濾膜上培養細胞模擬血腦屏障進行藥物轉運研究及檢測特定標誌物的表達，在氣液界面實現肺上皮細胞與血管內皮細胞共培養的氣血屏障等。ahhednc

多器官微流控晶片的設計及新應用

多器官微流控晶片設計ahhednc

多器官微流控晶片的設計基於PBPK的理念，可利用模型預測人體對藥物的反應以及藥物的作用機制。最常製造的裝置是尺寸在10~200mm之間的微流體通道，隔室的大小根據其功能正確地設計比例，不同的器官功能根據其機制的不同而具有不同的尺度。微流體系統材料通常採用聚二甲基矽氧烷，優化後多用多孔性較好的水凝膠，可允許水凝膠支架內的分子擴散。晶片製作後需要鑑定和測量培養的組織在用藥物或工程刺激物處理時的功能反應，進行細胞活力、機械力、電信號檢測以及化學分析等。ahhednc

目前，設計微流控晶片體系主要使用PBPK模型和PD模型。在PBPK模型中，藥代動力學 （Pharmacokinetics, PK）建模的方法用來設計和操作以再現多器官相互作用。PK建模可量化身體不同部位的藥物量，可用簡單的術語來描述藥物給藥後吸收、分布、代謝和消除的複雜過程，並深入了解藥物分布動力學。然而，建立一個生理學上準確的模型是十分困難的，因此限制了PK建模的廣泛使用。藥效動力學（Pharmacodynamics, PD）建模中藥理學作用被視為藥物濃度的函數，是針對藥物在體內的藥理作用的研究模型。單獨的PK模型不能闡明時間-藥效的關係，單獨的PD模型也不能闡明時間-濃度的關係，因此需要結合兩者建立PK-PD模型以研究藥物作用靶部位的濃度-效應-時間三維關係。在PBPK-PD模型中，PD模型與PK 模型耦合，使用組合的PK-PD模型來預測或分析給定劑量藥物的生理效應，綜合PK-PD模型可以評估特定劑量下藥物的生理結果的時間依賴性變化，應用性相對較廣泛。ahhednc

多器官微流控晶片的新應用

隨著多器官微流控晶片在藥物代謝方面應用研究的深入，也產生了各種新應用，如利用肺器官晶片研究納米材料毒性及代謝。哈佛大學通過研究肺對螢光納米顆粒傳遞至肺上皮細胞引發的一系列毒性反應，來探究應用於環境毒理學的肺晶片系統的潛在價值，為環境汙染物的體內代謝模擬研究開拓了新的視野。ahhednc

與大氣汙染物有關的癌症病例中，細顆粒物PM2.5起至關重要的作用，PM2.5可以穿透人體肺屏障並進入血液系統引發各種疾病甚至癌症。但其在體內的代謝途徑和致癌作用機理尚不明確。而目前研發的應用於藥代動力學和藥效學方面的多器官微流控晶片系統為該類研究提供了新的技術上的可能。為研究大氣汙染與疾病發生，目前研發的肺上晶片系統已經能夠測試空氣中的微粒和物質對單層細胞或三維細胞聚集體的毒性。基於微流控技術評估空氣品質對人類健康的影響，利用器官晶片模擬健康和病態肺的功能，對空氣傳播的汙染物暴露對呼吸系統的短期和長期影響進行無動物測試。與口服藥的代謝途徑不同，顆粒物在體內的代謝途徑主要有兩種：一是經皮膚入血，經由心入肺再進入體循環分配到肝和腎；二是經肺泡入血進入體循環分配到肝和腎。而未知濃度的真實大氣顆粒物樣品進入體內的分布和代謝由於難以監測，無法確定其濃度，因此缺乏相應的數學模型來進行後續的研究和預測，目前多是採用螢光標記的人造顆粒物來進行模擬。因此在肺晶片相關毒性研究的基礎上，設計合理的真實反應顆粒物體內代謝的多器官微流控晶片系統，建立完整的模擬顆粒物代謝的體外平臺、精準確定顆粒物代謝途徑、制定精確的代謝模型並進一步揭示顆粒物的致癌機理是亟待進一步深入研究的重要科學問題。ahhednc

此外，微晶片製造通過微電子機械系統（Microelectromechanical systems, MSMS）與晶片實驗室和器官微流控晶片系統相結合，MEMS允許將幾種微小或納米微傳感器、致動器、加速度計、熱控制器、微流體推進器、微波設備、衛星通信等的各種組件最小化，可用於衛星等航天技術，也可用於監測沙塵暴或火山活動等產生的汙染源。ahhednc

展望

微流控技術由微加工技術與三維培養相結合產生，在體外細胞培養中潛力較高。多器官微流控晶片技術可在微尺度對流體精準控制，模擬人體生理環境，克服了傳統二維細胞培養模式與動物實驗的不足，具有高度仿生性。MOC系統的發展結合了工程技術的優點，可調整流體流動和微通道中可控的局部組織-流體比率。MOC技術旨在建立人工的仿生環境，在器官-組織水平上模擬，以研究不同器官細胞之間的相互作用、相關生理代謝途徑以及生理毒性檢測等。ahhednc

人體晶片（Human-on-a-chip）是一種利用微加工技術，基於MOC系統將多個器官微流控晶片連用反映人體整體系統的仿真體系。自2011年NIH、FDA和國防部人體晶片專項設立以來，全世界範圍內掀起了人體晶片的研究熱潮。Human-on-a-chip旨在通過動態控制細胞微環境的各種培養條件，在微流控晶片上模擬人類多個器官主要功能，從而達到復原晶片上的「人體」系統。相較於單器官晶片，人體晶片更能全面反映機體器官功能的複雜性、功能變化和完整性，並且應用性更強。ahhednc

目前，基於MOC系統的發展和完善，已經實現了體外模擬心臟、生物血管、肺癌細胞轉移、 腸道功能和腎臟生物屏障等環境。雖然MOC克服了傳統二維細胞和動物實驗的諸多不足，但是也面臨晶片設計上器官的縮放、高通量分析、晶片上的檢測分析、疾病模型和細胞來源等問題，在實驗中涉及到的長期的動態營養平衡、器官的細胞和組織穩態、毒性檢測的完整性、檢測方法的特異性和靈敏度、晶片的材料等依舊是MOC系統亟待解決和完善的。此外，MOC在生物學研究、醫學、毒性測試、藥物代謝等領域應用比較多，但在進入體內的汙染物比如顆粒物PM2.5對人體的毒害及體內代謝方面研究極少。相信隨著技術的發展和研究的深入，MOC系統將廣泛應用於醫學、藥學、生命科學等領域，我們離『Human-on-a-chip』的實現亦越來越近。ahhednc

（來源：微迷）ahhednc